实验目的：探讨GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂及钙通道拮抗剂对血小聚集与释放反应的影响，从信号转导及血小板聚集的最后途径，为血栓性疾病的防治提供理论依据。 方法：1、标本来源：20～40岁，性别不限，近一个月内未用任何药物，排除冠心病、高血压、糖尿病及妊娠女性等引起高凝状态的疾病。 2、观察指标：1)静息血小板PAC-1(GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体)结合率和CD62P的表达率； 2)ADP(5μmol/L)诱导的PAG(M)(血小板最大聚集率)、PAC-1结合率与CD62P的表达率； 3)GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS(精氨酸—甘氨酸—天氡氨酸—丝氨酸)对PAG(M)、PAC-1结合率与CD62P表达率的作用； 4)Ca2+拮抗剂Nifedipine(硝苯地平)对PAG(M)、PAC-1结合率与CD62P表达率的作用； 5)RGDS和Nifedipine对PAG(M)、PAC-1结合率与CD62P表达率的联合效应。 3、方法与原理1)血小板聚集测定经静脉穿刺抽取新鲜血液，用ACD液(9：1)抗凝，分离血小板并用0.1％BSA的Hepes缓冲液悬浮，在血小板悬液中分别加入不同浓度的RGDS或Nifedipine，孵育2分钟后在TYXN-91智能血液凝聚仪上根据比浊法原理测定血小板聚集率(PAG)。以PAG(M)为观察指标。 2)血小板膜糖蛋白CD62P和GPⅡb/Ⅲa测定ACD抗凝新鲜全血，分别加入不同浓度的RGDS或Nifedipine，孵育10min，加入ADP(5μmol/L)孵育5min，实验组加入PAC-1：FITC，CD62P：PE、CD61：PerCP，对照组分别加入MouseIgG：PE、MouseIgM：FITC、CD61：PerCP染色，用1％甲醛溶液固定30min，24h内上机检测。 四统计分析1.计量资料的描述用均数±标准差((x)±s)表示2.抑制率的计算：(空白对照值—用药后值)/空白对照×100％3.随机区组设计的方差分析4.析因设计的方差分析5.两变量的线性相关分析6.所有数据均用SPSS11.0统计软件处理，检验标准：P≤0.05有统计学意义 结果：1ADP诱导的血小板活化正常人，静息状态下的血小板PAC-1结合率和CD62P表达率分别为(0.80±0.85)％和(3.03±0.70)％；ADP(5μmol/L)激动后，血小板PAC-1结合率和CD62P表达率分别为(77.27±9.47)％和(64.09±17.60)％，PAG(M)为(82.53±6.91)％。 2Nifedipine对血小板PAG(M)的作用Nifedipine可呈浓度依赖性地抑制血小板PAG，在所取(10～160μmol)内5种浓度下，每种浓度Nifedipine对PAG(M)的抑制作用，经方差分析，有统计学意义，半数抑制浓度(IC50)在160μmol/L左右。 3RGDS对血小板PAG(M)作用RGDS可呈浓度依赖性地抑制血小板PAG，在所取(50～800μmol)内5种浓度下，每种浓度RGDS对PAG(M)的抑制作用，经方差分析，有统计学意义(P＜0.05)，半数抑制浓度(IC50)在200μmol/L左右。 4Nifedipine和RGDS对血小板PAG(M)的联合作用Nifedipine(160μmol)和RGDS(200μmol)对血小板PAG(M)的联合抑制率为(62.35±15.95)％，经析因设计的方差分析，存在交互效应(P＜0.05)。 5Nifedipine对血小板PAC-1结合率和CD62P表达率的作用Nifedipine在所取(10～160μmol)内5种浓度下，每种浓度Nifedipine对PAC-1结合率和CD62P表达率均有抑制作用，经方差分析，有统计学意义(P＜0.05)，IC50均在160μmol/L左右。不同之处在于，经多重比较分析(S-N-K法)Nifedipine呈浓度依赖性地抑制PAC-1结合率，而呈非浓度依赖性地抑制CD62P表达率。 6RGDS对血小板PAC-1结合率和CD62P表达率的作用RGDS在所取(50～800μmol)内5种浓度下，每种浓度RGDS对PAC-1结合率的抑制作用，经方差分析，有统计学意义(P＜0.05)，且呈浓度依赖性，IC50在200μmol/L左右；当浓度＞200μmol/L时对血小板CD62P表达率的抑制作用有统计学意义(P＜0.05)，且抑制率较弱，800μmol/L时抑制率为27.31％。 7Nifedipine和RGDS对血小板PAC-1结合率和CD62P表达率的作用的联合作用 Nifedipine(160μmol)和RGDS(200μmol)对血小板PAC-1结合率的联合抑制率为(60.15±16.35)％，经析因设计的方差分析，存在交互效应(P＜0.05)。说明Nifedipine(160μmol/L)和RGDS(200μmol/L)对血小板PAC-1结合率的抑制作用相互加强。而二药联合对血小板CD62P表达率的联合抑制率为(57.85±17.14)％，析因设计的方差分析，无统计学意义(P＞0.05)，不存在交互效应。 8Nifedipine对血小板PAG(M)、PAC-1结合率和CD62P表达率作用的关系相同浓度的条件下，Nifedipine对血小板PAG(M)、PAC-1结合率和CD62P表达率作用具有相关性，PAG(M)与PAC-1结合率和CD62P表达率相关(P＜0.05)，相关系数分别为0.947、0.954；PAC-1结合率和CD62P表达率相关(P＜0.05)相关系数为0.968。 9RGDS对血小板PAG(M)、PAC-1结合率和CD62P表达率作用的关系相同浓度的条件下，RGDS对血小板PAG(M)、PAC-1结合率和CD62P表达率作用具有相关性。PAG(M)与PAC-1结合率和CD62P表达率相关(P＜0.05)，相关系数分别为0.992、0.976；PAC-1结合率与CD62P表达率相关(P＜0.05)相关系数为0.965。 结论：1.GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS和Ca2+拮抗剂Nifedipine能抑制ADP诱导的血小板聚集，抑制作用呈浓度依赖性，随拮抗剂浓度增加抑制作用增强；两者对血小板聚集的抑制存在正协同作用。 2.GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS和Ca2+拮抗剂Nifedipine能抑制ADP诱导的血小板GPⅡb/Ⅲa活化，抑制作用呈浓度依赖性，随拮抗剂浓度增加抑制作用增强；两者对血小板GPⅡb/Ⅲa活化的抑制存在正协同作用。 3.GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS在浓度大于200μmol/L时对ADP诱导的血小板释放反应有抑制作用，但抑制作用比较弱；Ca2+拮抗剂Nifedipine能呈非浓度依赖性抑制血小板释放反应；两者对血小板释放反应的抑制无协同作用。