研究目的和背景肝癌细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是世界第五大肿瘤和第三大致死性肿瘤,高发于东亚与撒哈拉以南非洲等地区[1,2]。肝细胞肝癌的发生是一个多因素、多步骤、多阶段的发展过程,病毒性肝炎、肥胖以及Ⅱ型糖尿病是已知的关键致病因素[31。由于缺乏早期诊断及有效的治疗手段,肝细胞肝癌患者的预后不佳,五年生存率水平极低[4]。如何由致病因素发展到肝细胞肝癌的中间过程,存在许许多多未知的环节。因此,需要通过更多的深入研究,了解肝细胞肝癌发生发展的分子病理机制,来寻找肝细胞肝癌早期诊断标志、治疗肝细胞肝癌有效靶点。Erbin 蛋白分子是 LAP(leucine-rich repeat and PDZ domain)蛋白家族的重要成员之一,属于极性蛋白分子。在分子结构上,人Erbin由1412位氨基酸所组成,包括N端的16个LRR重复序列及C端一个PDZ结构域[51。目前研究中,有关Erbin在调节细胞增殖与分化、发育、炎症、肿瘤发生与转移中的重要性受到越来越多的关注[6-9]。在本论文中,我们将目光投向Erbin在肝细胞肝癌发生发展中的作用,通过临床样品分析、肝癌细胞株的生物学特性及Erbin基因突变小鼠等多个水平来展开研究。研究方法1、Erbin在临床肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌标本中Erbin表达水平的检测及相关分析。1.1通过肝炎肝硬化组织芯片分析Erbin在肝炎与肝硬化中的表达情况。1.2对214例肝癌标本免疫组化染色分析Erbin的表达情况,深入挖掘Erbin表达水平与相关临床指标间的联系。1.3 Erbin在肝细胞肝癌中的表达水平与患者生存状况关系。1.4统计分析:应用SPSS 16.0软件进行数据分析。Multiple comparisons(LSD)分析LV20812芯片中正常肝组织、肝炎肝组织、肝硬化肝组织的Erbin的表达差异;Paired-Samples T test分析患者肝细胞肝癌与癌旁的表达差异,Multiple comparisons(LSD 及 Dunnett T3)分析 Erbin 表达在高、中、低分化肝细胞肝癌中的差异,χ2检验分析Erbin高表达与低表达与相关基本病理指标间的关系;Kaplan-Meier分析临床随访病例中Erbin表达水平与患者生存预后间的关系,χ2检验分析Erbin高表达与低表达与相关临床指标的关系。2、Erbin稳定干扰对肝癌细胞体内外生物学特性的影响。2.1从mRNA、蛋白水平别检测在人肝癌细胞株MHCC97H、MHCC97L、HCCLM6、SMMC7721、BEL7402、QGY7703、Huh7、HepG2及永生化肝细胞株L02中的表达情况。2.2构建SMMC7721与BEL7402 Erbin稳定干扰细胞株。2.3应用Erbin稳定干扰细胞株进行平板克隆形成实验、CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室细胞迁移实验、FN细胞粘附实验。2.4应用Erbin稳定干扰细胞株进行裸鼠皮下成瘤实验。2.5统计分析:应用SPSS 16.0软件进行数据分析,CCK-8细胞增殖实验结果采用析因方差分析,皮下成瘤实验结果采用重复测量的方差分析,平板克隆形成、Transwell小室迁移及FN粘附能力测定等实验结果均用One-way ANOVA分析。3、ErbinΔC/ΔC基因突变小鼠炎症及肿瘤模型的建立及观察。3.1 C57小鼠中CCL4急性肝炎模型、肝硬化模型的建立和Erbin表达情况的初步观察。3.2 ErbinΔC/ΔC基因突变小鼠的PCR基因鉴定。3.3 ErbinΔC/ΔC基因突变小鼠CCL4急性肝炎模型、肝硬化模型的建立和谷丙转氨酶与谷草转氨酶的测定。3.4 ErbinΔC/ΔC基因突变小鼠DEN诱导的肝癌模型的建立及观察。3.5 ErbinΔC/ΔC基因突变小鼠DEN+CCL4诱导的肝癌模型的建立及观察。3.6统计分析:应用SPSS 16.0软件对数据进行分析,One-way ANOVA分析小鼠急性炎症及肝硬化时ALT及AST的变化;Independent T test分析DEN及CCL4+DEN诱导肝癌在成瘤大小与成瘤数目的上的差异,χ2检验分析DEN及CCL4+DEN在成瘤率方面的差异。4.Erbin在肝细胞肝癌发生发展中作用机制的探讨。4.1.Erbin PDZ结构域特异性识别抗体的制备及检验。4.2 Erbin瞬时敲低对肝癌细胞细胞周期的影响。4.3 Erbin瞬时敲低对对肝癌相关肿瘤干细胞标志的影响。4.4 Erbin通过影响ERα信号促进肝细胞肝癌的生长。4.5质谱分析寻找Erbin在肝细胞肝癌中新的可能相互作用蛋白。4.6 RNA-seq分析Erbin瞬时敲低对相关基因及信号通路的影响。4.7统计分析:应用SPSS 16.0软件对数据进行分析,IndependentT test分析细胞周期及荧光定量PCR结果。结果1、Erbin在临床肝炎、肝硬化标本中Erbin表达水平的检测及相关分析。1.1 Erbin在临床肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌标本中Erbin表达水平的检测及相关分析。胞浆染色评分:Erbin在正常组织中(n=16)表达得分为2.750±1.169,肝炎肝组织中表达得分4.208±2.172,肝硬化肝组织中表达得分5.641±2.178;经Multiple comparisons(LSD)分析得出,肝炎肝组织得分较正常肝组织得分差异有统计学意义(P=0.024),肝硬化肝组织得分较正常肝组织差异有统计学意义(P<0.001)、较肝炎肝组织差异有统计学意义(P=0.011)。(图1-1)胞核染色评分:Erbin在正常组织中(n=16)表达得分为0.594±0.712,肝炎肝组织中表达得分1.313±1.092,肝硬化肝组织中表达得分1.641±1.116;正常肝组织细胞核着色阳性率为50%,肝炎肝组织细胞核着色阳性率为70.83%,肝硬化肝组织细胞核阳性率为81.25%。经Multiple comparisons(Dunnett T3)分析得出,肝炎肝组织核着色得分较正常肝组织得分差异有统计学意义(P=0.035),肝硬化肝组织得分较正常肝组织差异有统计学意义(P=0.00l)、较肝炎肝组织差异无统计学意义(P=0.244);肝硬化肝组织细胞核着色阳性率较正常肝组织细胞核着色阳性率差异有统计学意义(P=0.026)。(图1-1)1.2 Erbin在肝细胞肝癌中的表达情况及分析。Paired-Samples T test分析患者肝细胞肝癌与癌旁的表达差异:肝细胞肝癌组织得分为5.266±2.613,癌旁组织得分为4.528±1.900,两者差异有统计学意义(t=3.356,df=213,P=0.001)。Multiple comparisons(LSD)分析 Erbin 表达在高、中、低分化肝细胞肝癌中的差异:高分化肝细胞肝癌得分为3.654±1.832(n=26),中分化肝细胞肝癌得分4.939±2.609(n=130),低分化肝细胞肝癌得分6.724±2.246(n=58);三者组间差异具有统计学意义(F=17.296,P<0.001);其中,中分化组较高分化组差异有统计学意义(P=0.015),低分化组较高分化组差异有统计学意义(P<0.001)、较中分化组差异有统计学意义(P<0.001)。χ2检验分析Erbin高、低表达组与肝细胞肝癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、分化、AJCC分期等临床指标的关系。结果表明:Erbin的表达水平与肝细胞肝癌的高、中、低分化间差异有显著性(P=0.000)。1.3 Erbin在肝细胞肝癌中的表达与患者生存状况分析。Kaplan-Meier分析Erbin低表达与高表达肝细胞肝癌患者生存时间的差异:根据免疫组化的平均得分5.266±2.613,将医院收集131例肝细胞肝癌随访病例分为Erbin低表达组(n=63)、高表达组(n=68);Erbin低表达组(n=63)平均生存时间为34.199月、中位生存时间为23.6月,Erbin高表达组平均生存时间为15.196月、中位生存时间为7.567月;Erbin高表达与低表达组差异有显著性(Log Rank χ2 =19.100,P<0.001)。χ2检验分析Erbin表达高低与相关临床指标间的关系。结果表明:Erbin的表达水平与临床肝细胞肝癌的高、中、低分化问差异有显著性(P=0.022);与临床肝细胞肝癌患者的CLIP分期间差异有显著性(P=0.042)。2.Erbin稳定干扰对肝癌细胞体内外生物学特性的影响。2.1检测Erbin在肝癌细胞株及有永生化肝细胞株中的表达情况。western blot检测及对结果的灰度分析定量表明,Erbin在肝癌细胞株中的表达均高于永生化肝细胞株L02;同时,在肝癌细胞株中,MHCC97L、HCCLM6、SMMC7721 BEL7402、HepG2 等细胞株中 Erbin 表达相对较高,MHCC97H、QGY7703、Huh7等细胞株Erbin表达相对较低。荧光定量PCR结果表明,大部分肝癌细胞株(除QGY7703)中Erbin mRNA水平的表达高于永生化肝癌细胞株 L02;其中,BEL7402、SMMC7721、HCCLM6、HepG2 等细胞株 Erbin 表达相对较高,MHCC97H、MHCC97L、QGY7703、Huh7 等细胞株中Erbin表达水平相对较低。2.2 Erbin稳定干扰人肝癌细胞株的建立。根据Erbin在肝癌细胞株中的表达水平,选择SMMC7721及BEL7402这两株肝癌细胞构建Erbin稳定干扰的细胞株。经慢病毒转染48h后,于荧光倒置显微镜下即可观测到转染成功后带GFP荧光的细胞。逆转录-荧光定量PCR结果经One-way ANOVA分析表明,SMMC7721稳定干扰Erbin细胞株(SMMC7721/shRNA)与对照组细胞(SMMC7721/NC)相比差异具有显著性(F=68.196,P<0.001);BEL7402 稳定干扰 Erbin 细胞株(BEL7402/shRNA)与对照组细胞(BEL7402/NC)相比差异具有显著性(F=86.723,P<0.001)。2.3 CCK-8细胞增殖能力检测结果经析因方差分析表明:SMMC7721细胞干扰组与对照组差异具有显著性(F=489.849,P<0.001);不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=1519.548,P<0.001);各组细胞与各个时间组两因素交互效应显著(F=36.868,P<0.001);除第1天(F=0.079,P=0.786)外,其余时间点细胞组间增殖差异具有显著性。Erbin稳定干扰后,SMMC7721细胞增殖速度减慢。BEL7402细胞干扰组与对照组差异具有显著性(F=201.595,P<0.001);不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=1897.042,P<0.001);各组细胞与各个时间组两因素交互效应显著(F=27.434,P<0.001);除第1天(F=1.732,P=0.225)外,其余时间点细胞组间增殖差异具有显著性。Erbin稳定干扰后,BEL7402细胞增殖速度减慢。2.4平板克隆形成实验。经One-way ANOVA分析,平板克隆形成实验结果显示,SMMC7721稳定干扰Erbin细胞株(SMMC7721/shRNA)与对照组细胞(SMMC7721/NC)相比克隆形成能力下降,差异具有显著性(F= 143.685,P<0.001);BEL7402稳定干扰Erbin细胞株(BEL7402/shRNA)与对照组细胞(BEL7402/NC)相比克隆形成能力下降,差异具有显著性(F= 273.014,P<0.001)。2.5 FN粘附能力检测。经One-way ANOVA分析,FN粘附能力实验结果显示,SMMC7721稳定干扰Erbin细胞株(SMMC7721/shRNA)与对照组细胞(SMMC7721/NC)相比粘附能力增强,差异具有显著性(F=19.434,P=0.002);BEL7402稳定干扰Erbin细胞株(BEL7402/shRNA)与对照组细胞(BEL7402/NC)相比相比粘附能力增强,差异具有显著性(F= 14.620,P=0.005)。2.6 Transwell小室体外迁移实验。经 One-way ANOVA 分析,Transwell小室体外迁移实验结果显示,SMMC7721稳定干扰Erbin细胞株(SMMC7721/shRNA)与对照组细胞(SMMC7721/NC)相比细胞迁移能力增强,差异具有显著性(F= 66.17,P<0.001);BEL7402稳定干扰Erbin细胞株(BEL7402/shRNA)与对照组细胞(BEL7402/NC)相比细胞迁移能力增强,差异具有显著性(F= 409.301,P<0.001)。2.7裸鼠体内成瘤实验。经Repeated Measures分析表明:SMMC7721稳定干扰Erbin细胞株(SMMC7721/shRNA)与对照组细胞(SMMC7721/NC)相比裸鼠皮下成瘤速度减慢、成瘤体检减小,差异具有显著性(F= 31.648,P<0.001);不同时间点对细胞体内成瘤的影响差异具有显著性(F=25.478,P<0.001);各组细胞与各个时间组两因素交互效应显著(F=22.269,P<0.001);除第7天(F=1.220,P=0.228)外,其余时间点细胞组间增殖差异具有显著性。BEL7402细胞干扰组与对照组相比裸鼠皮下成瘤速度减慢、成瘤体检减小,差异具有显著性(F=26.637,p<0.001);不同时间点对细胞体内成瘤的的影响差异具有显著性(F=42.629,P<0.001);各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(F=12.967,P<0.001);除第1天(F=2.004,P=0.195)外,其余时间点细胞体内成瘤差异具有显著性。3.ErbinΔC/ΔC基因突变小鼠炎症及肿瘤模型的建立及观察。3.1 C57小鼠CCL4诱导的急性炎症模型。小鼠肝组织经石蜡包埋、切片、HE染色后,于显微镜下观察到:12h时,肝细胞发生变性水肿、肝血管充血扩张;24h时,肝细胞变性水肿加重、部分肝细胞坏死、血管充血扩张加重;48h时,见大片坏死,出血。WB检测结果表明:在CCL4诱导24h、48h时,小鼠肝细胞Erbin蛋白水平的表达急剧下降。3.2 C57小鼠CCL4诱导的肝硬化模型。小鼠肝组织经石蜡包埋、切片、HE染色后,于显微镜下观察到:CCL4诱导16周并停止CCL4注射1周后,小鼠肝小叶周边纤维组织增生,肝小叶分割界限明显,肝血管充血扩张。WB检测结果表明:在CCL4诱导16周后,对比Oil注射小鼠,肝细胞Erbin蛋白水平的表达上调。3.3ErbinΔC/ΔC小鼠的PCR鉴定。在琼脂糖凝胶上,ErbinΔC/ΔC小鼠野生型(WT)见一扩增大小在400bp-500bp间的条带;ErbinΔC/ΔC小鼠纯合子(Ho)见一扩增大小在300bp-400bp间的条带;ErbinΔC/ΔC小鼠杂合子(He)见300bp-400bp间与400-500bp间两条扩增条带。3.4 ErbinΔC/ΔC小鼠CCL4诱导的急性炎症模型。H&E染色显示:ErbinΔC/ΔC纯合子小鼠较野生型小鼠,在急性炎症反应中更加严重;在CCL4诱导肝损伤修复的第6天,纯和子小鼠肝脏血管充血明显、汇管区仍可见多量的炎症细胞浸润。在急性肝炎的第6天,纯合子小鼠较野生型小鼠血清ALT与AST差异有统计学意义(ALT:F=7.200,P=0.028;AST:F=35.478,P<0.001)。3.5 ErbinΔC/ΔC小鼠CCL4诱导的肝硬化模型。H&E染色显示:ErbinΔC/ΔC纯合子小鼠较野生型小鼠,在CCL4诱导的肝硬化中纤维胶原增生更加严重;镜下见,纯合子小鼠增生的纤维组织将肝组织分割,形成明显的团块状。肝硬化ErbinΔC/ΔC小鼠中,纯合子小鼠较野生型小鼠血清ALT差异无统计学意义(ALT:F=0.890,P=0.342)、血清AST差异有统计学意义(AST:F=5.279,P=0.040)。野生型小鼠AST/ALT比值为0.364,纯合子小鼠AST/ALT比值为0.569,反应纯合子小鼠炎症反应较野生型小鼠严重。3.6 ErbinΔC/Δc小鼠DEN诱导的肝癌模型。出生后14-15天、雄性ErbinΔC/ΔC小鼠,以25mg/kg的剂量腹腔注射DEN,经36周观察后,断颈处死并解剖小鼠,详细观察记录野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠在成瘤率、成瘤数目、成瘤大小等方面的差异。实验结果如下:ErbinΔC/ΔC野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠肉眼观(>0.5mm记入)成瘤率经One-way ANOVA分析,差异有统计学意义(WT♂92.31%、Ho♂50%,F=11.58,P=0.002);ErbinΔC/Δc野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠成瘤大小(记每个小鼠的最大直径肿瘤)(mm)经T-Test分析,差异有统计学意义(WT♂4.0769±3.17393、Ho♂1.7143±1.89852,df=25/13,P<0.001);ErbinΔc/Δc野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠成瘤数目(>0.5mm记入)经T-Test分析,差异有统计学意义(WT♂11.6538±9.624、Ho♂3.4286±5.345,df=25/13,P<0.001)。3.7 ErbinΔC/ΔC小鼠CCL4+DEN诱导的肝癌模型。出生后14-15天、雄性ErbinΔC/ΔC小鼠,以25mg/kg的剂量腹腔注射DEN,在第12周、第20周、第28周分别给予一次腹腔注射2.5ul/g体重的20%CCL4,经32周观察后,断颈处死并解剖小鼠,详细观察记录野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠在成瘤率、成瘤数目、成瘤大小等方面的差异。实验结果如下:ErbinΔC/ΔC野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠肉眼观(>0.5mm记入)成瘤率经One-way ANOVA分析,差异无统计学意义(WT♂94.12%、Ho♂100%,F=0.401,P=0.533);ErbinΔC/ΔC野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠成瘤大小(记每个小鼠的最大直径肿瘤)(mm)经T-Test分析,差异有统计学意义(WT♂3.0882±2.10828、Ho♂2.2857±1.38013,df=16/6,P<0.001);ErbinΔC/ΔC 野生型小鼠(WT)与纯合子小鼠成瘤数目(>0.5mm记入)经T-Test分析,差异有统计学意义(WT♂15.3125±5.12144、Ho♂6.4286±3.82349,df=16/6,P<0.001)。4.Erbin在肝细胞肝癌发生发展中作用机制的探讨。4.1 Erbin兔源性抗体的制备及检测。经实验检验,该抗体可以用于人与小鼠的western blot、免疫荧光等实验,在免疫荧光染色实验中,Erbin PDZ抗体可定位于细胞浆与细胞核。4.2 Erbin敲低肝癌细胞的细胞周期检测。Erbin瞬时干扰的SMMC7721经流式细胞仪检测,对照组与干扰组G1期细胞所占百分比分别为61.7933±2.2377、75.6833±3.41791,S期细胞所占百分比分别为 18.9300±3.2261、17.1700±2.3383,G2期细胞所占百分比分别为19.2400±1.3479、7.1500± 1.0739。细胞周期结果显示:G1期延长、S期与G2期缩短。说明Erbin干扰后肝癌细胞于G1期阻滞,进入G2期及有丝分裂期的细胞数口减少,从而抑制了肝癌细胞的增殖4.3下调Erbin对肝癌相关肿瘤干细胞标志的影响。荧光定量PCR结果表明:Erbin瞬时干扰时,肝细胞肝癌的干性标志CD13与CD90表达上调,CD24与CD133表达下调。4.4 Erbin对ERα信号的影响的检测。4.4.1免疫荧光共聚焦检测Erbin与ERα的定位关系:在肝癌细胞SMMC7721细胞中,Erbin N-term红色荧光定位于细胞质内,Erbin PDZ红色荧光定位于细胞质及细胞核内,ERα绿色荧光定位于细胞质及细胞核内(其中胞核信号较强)。结果表明:ErbinPDZ红色荧光可以与ERα绿色荧光共定位与细胞核内。在肝癌细胞BEL7402细胞中,Erbin N-term红色荧光定位于细胞质内,Erbin PDZ红色荧光定位于细胞质及细胞核内,ERα绿色荧光定位于细胞质及细胞核内(其中胞核信号较强)。结果表明:Erbin PDZ红色荧光可以与ERα绿色荧光共定位与细胞核内。4.4.2 Western Blot检测Erbin稳定干扰及瞬时干扰肝癌细胞株中ERα的表达情况。在稳定干扰Erbin肝癌细胞株的Western Blot显示:Erbin稳定干扰后,ERα表达水平明显升高。在瞬时干扰Erbin肝癌细胞株的Western Blot显示:应用Erbin siRNA干扰片段1与2,瞬时干扰Erbin时,ERα表达水平均升高。结果表明在肝癌细胞中,Erbin抑制ERα信号。4.4.3 STRING蛋白质相互作用预测网站了解ERα的相互作用蛋白网络。4.4.4荧光定量PCR检测Erbin瞬时干扰情况下,ErbB4、EP300、SRC、ERβ、SP1、NRIP1、HDAC1等基因表达下调。4.5质谱分析筛选Erbin可能相互作用蛋白。通过对免疫共沉淀蛋白样品的免疫共沉淀分析,我得到34个Erbin的可能相互作用蛋白:4.6 SMMC7721肝癌细胞株Erbin瞬时干扰的RNA-seq分析。SMMC7721细胞株Erbin瞬时干扰RNA样品经华大基因公司RNA-seq分析发现,Erbin干扰组较对照组有5474个基因明显下调、2022个基因明显上调。对5474个基因明显下调及2022个基因明显上调进行pathway分析得出,Erbin干扰对 Spliceosome、RNA degradation、B cell receptor signaling pathway、Proteasome、pylori infection、Apoptosis、P53 pathway、cell cycle pathway、Metabolic pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter 等信号通路产生主要影响。结论1、Erbin在肝细胞肝癌中表达增强,与肝细胞肝癌的分化密切相关,高表达Erbin的肝癌患者预后较差。2、Erbin下调抑制肝细胞肝癌的在体内外的生长。3、Erbin PDZ结构域突变抑制肝癌的发生发展。4、Erbin表达下调时,引起肝癌细胞细胞周期G1期阻滞,并可能通过ERα信号的上调而抑制肝癌的生长;Erbin下调抑制肝癌细胞增殖主要通过影响代谢及细胞凋亡等信号通路起作用。