论文部分内容阅读
研究目的：通过检测双酚A (Bishpenol A, BPA)作用下子宫肌瘤细胞中GRP30-EGFR信号通路的变化,探讨该信号通路在子宫平滑肌瘤细胞增殖中的分子机制,为降低人群中子宫肌瘤发病率的综合防治措施提供理论依据。研究方法：1、Real-Time PCR法及Western blot法研究15例平滑肌瘤组织及相邻的正常平滑肌组织中GPR30及EGFR的mRNA和蛋白的表达情况。2、原代培养子宫平滑肌瘤细胞,免疫细胞组化法鉴定平滑肌相关标志蛋白(a-Smooth Muscle Actin, a-SMA)的表达,应用CCK8法鉴定在BPA组(10μmol/L),G1组(GPR30特异性激动剂)(1μmol/L), G15组(GPR30特异性抑制剂)(1μmol/L),ICI182780组(雌激素受体拮抗剂)(1μmol/L), AG1478组(EGFR特异性抑制剂)(10μmol/L), PD98059组(非竞争性的MEK的抑制剂)(10μmol/L), G15+BPA组(1μmol/L+10μmol/L), ICI182780+BPA组(1μmol/L+10μmol/L), AG1478+BPA组(10μmol/L+10μmol/L), PD98059+BPA组(10μmol/L+10μmol/L)及DMSO对照组分别观察子宫肌瘤细胞的增殖情况。3、用Real-Time PCR法及Western bolt法研究各组细胞中GPR30及EGFR的mRNA和蛋白的表达情况。4、通过Western bolt法测定的p-ERK1/2、c-fos的表达,研究EGFR的下游通路的MAPK/ERK信号通路的影响。研究结果：1、GPR30及EGFR mRNA和蛋白在子宫肌瘤组织中的表达高于瘤旁正常的平滑肌组织,且具有统计学意义(P<0.05)。2、成功建立子宫肌瘤细胞5-6代有限增殖细胞系,并且用免疫细胞组化法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。3、CCK8法研究发现在10μmol/L BPA能够促进子宫肌瘤细胞增殖,而用GPR30-EGFR信号通路的抑制剂G15、AG1478、PD98059均能够抑制BPA对子宫肌瘤细胞的增殖作用。4、Real-Time PCR法及Western bolt法研究发现：BPA组、G1组均能使GPR30、EGFR的mRNA和蛋白表达上调,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)；而采用GPR30-EGFR信号通路中的GPR30抑制剂G15、EGFR抑制剂AG1478、MEK抑制剂PD98059能够使GPR30、EGFR的mRNA和蛋白表达下调,和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；G15组、AG组、PD组和BPA协同作用后,GPR30、EGFR的mRNA和蛋白的表达相对于BPA单独作用组有所下调,差异有统计学意义(P<0.05)。5、Western bolt法测定EFGR的下游通路中c-fos、p-ERK1/2的研究发现BPA、G1组与对照组相比,均能使c-fos、p-ERK1/2表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),G15组、AG组、PD组与对照组相比,能够使c-fos、p-ERK1/2蛋白的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)；G15组、AG组、PD组和BPA协同作用后,与单独BPA组相比,c-fos、p-ERK1/2蛋白的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1、子宫平滑肌瘤组织中GPR30和EGFR的表达水平升高。2、BPA可促进子宫平滑肌瘤细胞的增殖。其机制可能与GPR30-EGFR及其下游MAPK/ERK/c-fos信号通路的激活有关。