自1978年全世界第一例“试管婴儿”路易斯.布朗出生以来,以体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)和卵细胞浆内单精子注射(intracytoplasm sperm injection,ICSI)为代表的现代辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)已经成为当前人类不孕不育最为有效的治疗手段。然而ART技术在造福广大不孕不育患者的同时,流行病学资料表明ART子代存在出生儿体重改变,出生缺陷率上升等风险。此外,ART对DNA表观遗传学的影响也得到了广泛的关注和研究。关于ART技术是否存在改变人类遗传学物质构型、损伤人类遗传物质、影响DNA突变修复的风险还存在争议。而本课题组的研究报道,通过ART技术出生的子代的基因动态突变的频率要高于自然妊娠子代,说明ART技术存在影响子代DNA稳定性的潜在风险。在生物进化过程中,生物细胞形成了 DNA损伤修复系统,能够保持DNA结构和功能的完整性。目前,生物体内的损伤修复途径主要包括碱基切除修复(base excision repair,BER),核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER),错配修复(mismatch repair,MMR),双链断裂修复(DNA doublestrand break repair,DSB)和跨损伤DNA合成(translesion DNA synthesis,TLS)。而基因动态突变作为一种DNA损伤,它与某些类型的DNA损伤修复机制例如DNA错配修复,DNA切除修复存在着密切联系。结合ART对DNA表观遗传学修饰的影响,关于ART是否会导致子代DNA损伤修复相关基因表达和甲基化修饰状态的改变是一个亟待回答的科学问题。因此在第一部分研究中,通过收集IVF、ICSI和单纯药物卵巢刺激(control ovarian stimulation,COS)组的三胎妊娠胚胎减灭术后的早孕期胎儿组织,选择与基因动态突变相关的DNA损伤修复基因为目的基因,包括MMR系统中的MSH2(MutS homolog 2)、MSH3(MutS homolog 3)、MSH6(MutS homolog 6)、MLH1(MutL homolog 1)和 PMS2(Postmeiotic segregation increased 2);BER 系统的 OGG1(8-oxoguanine DNA glycosylase)和 APEX1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1)和 NER 系统的RPA1(Replication protein A1)和(Xeroderma pigmentosum complementation group A),使用荧光定量PCR(Real-time PCR),蛋白质免疫印记(Western blot),焦磷酸盐测序(Pyrosequencing)等方法研究其表达及甲基化修饰水平变化,探索ART(包括IVF中配子和胚胎的体外操作和培养、ICSI中所涉及的机械性操作)对早孕期胎儿组织中DNA损伤修复基因表达及甲基化修饰状态的影响。在评估ART早孕期胎儿组织中DNA损伤修复基因表达及甲基化修饰状态之后,结合DNA损伤修复系统和基因动态突变在神经退行性疾病发生发展过程中发挥的重要作用,因此在第二部分研究中,通过构建体内受精(in vivo fertilization,IVO)和IVF小鼠模型,选择脑组织为靶组织,取3周(断乳期),10周(性成熟期)和1.5年(老年期)的小鼠脑组织,分析DNA损伤修复相关基因的表达和甲基化修饰情况,探索IVF对出生后小鼠脑组织中DNA损伤修复基因的近期、中期和远期影响及其分子机制。最后通过体外受精-胚胎培养(in vitro fertilization and embryo culture,IVF-EC)获取小鼠胚胎,探索体外操作和培养环境条件对小鼠胚胎中DNA损伤修复基因的影响,并通过分析不同培养条件下小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)中DNA损伤修复基因的表达和甲基化修饰状态进行验证,探索ART早孕期胎儿组织和IVF出生后小鼠脑组织中DNA损伤修复基因异常改变发生的可能关键作用环节和作用时间点,为ART技术改进提出可能的途径,为降低ART子代风险提供科学依据。第一部分ART早孕期胎儿组织DNA损伤修复基因的表达与甲基化修饰研究研究目的:研究DNA损伤修复相关基因在ART早孕期胎儿组织中的表达,并研究相关基因启动子区域的甲基化修饰状态,探索ART过程影响早孕期胎儿组织的DNA损伤修复相关基因的效应和发生机制。材料和方法:1.收集2012年-2015年在浙江大学医学院附属妇产科医院行IVF、ICSI和COS的三胎妊娠胚胎减灭术病例,获取早孕期胎儿组织,其中包括32例IVF,20例ICSI和32例COS早孕期胎儿组织。2.提取上述三组早孕期胎儿组织的RNA,选择与动态突变相关的DNA损伤修复基因为目标基因,通过荧光定量PCR检测三组早孕期胎儿组中DNA损伤修复基因MSH2,MSH3,MSH6,MLH1,PMS2,OGG1,APEX1,XPA 和 RPA1 的 mRNA表达水平。3.提取上述三组早孕期胎儿组织的DNA,通过焦磷酸测序检测三组早孕期胎儿组织中MSH2,MSH3,MSH6,MLH和APEX1基因启动子区域甲基化修饰状态。4.提取上述三组早孕期胎儿组织的蛋白,通过western-blot检测三组早孕期胎儿组织中 MSH2,MSH3,MSH6,MLH1,APEX1 的表达水平。结果:1.mRNA 水平:在 IVF 组与 ICSI组中,MSH2,MSH3,MSH6,MLH1 和APEX1基因的表达水平显著低于COS组;在ICSI组中,PMS2和XPA基因的表达水平显著低于COS组,XPA基因的表达水平显著低于IVF组。2.DNA 甲基化修饰水平:MSH2,MSH3,MSH6,MLH1和 基因的 CpG岛的甲基化位点在IVF组与ICSI组均与COS组之间存在甲基化率的差异并有统计学意义;MSH2,MSH3,MSH6,MLH1和APEX1基因的CpG岛的甲基化率在IVF组与ICSI组之间差异无统计学意义。3.蛋白水平:MSH2,MSH3,MSH6,MLH1和APEX1蛋白的表达水平在COS组,IVF组和ICSI组之间差异无统计学意义。结论:1.IVF和ICSI早孕期胎儿组织中部分DNA损伤修复基因呈现低表达,其发生可以用DNA损伤修复基因启动子区域CpG岛的高甲基化水平解释。2.IVF和ICSI早孕期胎儿组织中DNA损伤修复基因的表达和甲基化修饰改变情况类似,但与COS早孕期胎儿组织存在明显差异,表明此类改变可能是由IVF和ICSI的共同作用环节-胚胎体外操作和培养过程引起的。3.IVF和ICSI早孕期胎儿组织中DNA损伤修复相关基因的mRNA水平与蛋白水平不一致,可能与转录后调控有关。第二部分 IVF对小鼠脑组织DNA损伤修复基因表达与甲基化修饰影响的研究研究目的:研究不同年龄段IVF小鼠脑组织中DNA损伤修复基因的表达以及差异基因的甲基化修饰状态,探索IVF过程对出生小鼠脑组织DNA损伤修复基因的短期、中期和长期影响及其发生机制。材料和方法:1.应用已建模的IVO和IVF小鼠模型,取3周(断乳期),10周(性成熟期),1.5年(老年期)3组小鼠左侧额叶脑组织,每组包括6只IVF小鼠和6只IVO小鼠(每组小鼠雌雄比率相同),选择DNA损伤修复基因MSH2,MSH3,MSH6,MLH1,PMS2,OGG1,APEX1,XPA 和 RPA1为目标基因。2.通过荧光定量PCR检测3周、10周及1.5年时期IVF组和IVO组小鼠脑组织中 MSH2,MSH3,MSH6,MLH1,PMS2,OGG1,APEX1,XPA 和 RPA1 的表达水平。3.通过焦磷酸测序检测3周、10周及1.5年时期IVF组和IVO组小鼠脑组织中的相关差异基因启动子区域甲基化修饰状态。4.通过western-blot检测3周、10周及1.5年时期IVF组和IVO组小鼠脑组织中的相关差异基因的蛋白表达水平。结果:1.mRNA水平:在3周时,MSH2,MSH6和MLH1基因的表达水平在IVF组和IVO组之间存在差异并有统计学意义;在10周时,MSH2和MSH6基因的表达水平在两组之间存在差异并有统计学意义;在1.5年时,MSH2,MSH6,MLH1,OGGI和APX1基因的表达水平在两组之间存在差异并有统计学意义。2.DNA甲基化修饰水平:在3周时,MSH2,MSH6和MLH1基因的甲基化率在IVF组与IVO组之间存在差异并有统计学意义;在10周时,MSH6基因的甲基化率在两组之间存在差异并有统计学意义,而MSH2基因的甲基化率在两组之间差异无统计学意义;在1.5年时,MSH2,MSH6,MLH1,OGG1和APEXI基因的甲基化率在两组之间存在差异并有统计学意义。3.蛋白水平:在3周时,MSH6蛋白的表达水平在IVF组显著低于IVO组;在10周时,两组之间的各个蛋白表达水平差异无统计学意义;在1.5年时,MSH6蛋白的表达水平在IVF组显著低于IVO组,OGG1蛋白的表达水平在IVF组显著高于IVO 组。结论:1.IVF出生小鼠脑组织中部分DNA损伤修复基因的表达及其启动子区域GpG岛的甲基化修饰水平存在改变。2.虽然3周龄的IVF小鼠脑组织中部分DNA损伤修复基因的表达和甲基化修饰水平改变在小鼠生长至10周龄时可以被部分纠正,但1.5岁高龄的IVF小鼠脑组织中此类基因又出现更显著的基因表达、甲基化修饰及其蛋白水平的改变。第三部分体外操作及培养条件对小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞DNA损伤修复基因影响的研究研究目的:研究不同的体外操作及培养环境条件对小鼠二细胞胚胎、囊胚和小鼠胚胎干细胞中DNA损伤修复酶基因表达和甲基化修饰的影响,探索子代DNA损伤修复基因表达和甲基化修饰状态改变的初始发生机制。材料和方法:利用C5 7BL/6J小鼠建立体内受精(IVO)和体外受精及培养(in vitro fertilization and embryo culture,IVF-EC)胚胎模型,通过在不同氧气浓度和雌激素浓度下培养小鼠二细胞胚胎和囊胚,选择DNA损伤修复基因MSH2,MSH3,MSH6,MLH1,PMS2,(OGG1,APEX1,XPA,RPA1 和 DNA 甲基转移酶 1(DNA Methyltransferase 1,DNMT1)为目标基因,通过荧光定量PCR检测不同培养条件下小鼠二细胞胚胎和囊胚中 DNA 损伤修复基因 MSh3,MSH6,MLH1,PMS2,OGG1,APEX1,XPA,RPA1和DNMT1基因的表达水平,并通过western blot和免疫荧光检测小鼠囊胚中的蛋白表达情况。同时通过在不同氧气和雌激素浓度下培养小鼠胚胎干细胞,检测其DNA损伤修复基因的表达和甲基化修饰状态。结果:1.体外操作及培养对小鼠二细胞胚胎中DNA损伤修复基因和DNMT1基因表达的影响在小鼠二细胞胚胎中,DNA损伤修复基因和DNMT1基因在20%O2 IVF-EC组,5%O2 IVF-EC组和IVO组三组之间的表达水平差异无统计学意义。2.体外操作及培养对小鼠囊胚中DNA损伤修复基因和DNMT1基因表达的影响(1)mRNA 水平:在 20%O2 IVF-EC 组中,MSH2,MSH3,MSH6,OGG1,APEX1和RPA1基因的表达水平低于IVO组并有统计学意义;DNMT1基因的表达水平显著高于IVO组并有统计学意义。在5%02IVF-EC组中,只有MSH2,MSH3,MSH6和RPA1基因的表达水平低于IVO组并有统计学意义,其中MSH2,MSH3和MSH6基因的表达水平高于20%O2IVF-EC组并有统计学意义,更加接近IVO组。(2)蛋白水平:MSH2,MSH3,MSH6,OGG1和APEX1蛋白的表达水平在20%O2 IVF-EC组,5%O2 IVF-EC组和IVO组三组之间差异无统计学意义。3.雌激素浓度对小鼠囊胚中DNA损伤修复基因和DNMT1基因表达的影响在小鼠囊胚中,DNA损伤修复基因和DNMT1基因的表达水平在不同浓度雌激素的IVF-EC组之间差异无统计学意义。4.氧气浓度对小鼠胚胎干细胞中DNA损伤修复基因表达和甲基化修饰状态的影响在5%氧气浓度培养组中,MSH2和MSH6基因的表达水平高于20%氧气浓度培养组;同时,MSH6基因启动子区域的CpG4位点呈现低甲基化。5.雌激素浓度对小鼠胚胎干细胞中DNA损伤修复基因表达和甲基化修饰状态的影响在小鼠胚胎干细胞中,DNA损伤修复基因的表达和甲基化修饰水平在不同浓度雌激素培养组之间差异无统计学意义。结论:1.体外操作和培养的小鼠囊胚中存在DNA损伤修复基因表达改变。2.体外操作和培养的小鼠囊胚中DNA损伤修复基因表达改变与胚胎培养环境中的高氧浓度暴露有关,与雌激素暴露无明显联系。3.胚胎培养环境中的高氧浓度暴露上调DNMT1基因表达,增加胚胎细胞中DNA损伤修复基因启动子区域GpG岛的甲基化水平,下调其基因表达水平是体外操作和培养的小鼠囊胚中DNA损伤修复基因表达改变的可能机制。4.胚胎培养环境中的高氧浓度暴露是ART出生子代DNA损伤修复基因表达和甲基化修饰改变的重要原因,推广使用体外低氧浓度的胚胎培养系统,有利于降低子代DNA损伤修复基因表达和甲基化修饰改变可能引发的安全性风险。