研究目的和内容1.为了解目前广州市淡水产品中香港海鸥形菌(Laribacter hongkongensis, LH)的携带情况,采集广州市的淡水鱼和食用蛙进行LH检测。2.为深入阐明LH的病原学特性,进行以下研究：分析LH分离株抗生素耐药表型；运用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)和肠道细菌重复基因间共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence, ERIC)PCR对分离株进行分型分析,评价菌株间的遗传亲缘关系；分析LH分离株中整合子-基因盒在耐药传播中的作用,以及耐药谱的遗传多样性。研究方法1.细菌培养分离鉴定方法。2.细菌16S rRNA基因PCR鉴定法。3.纸片扩散法确定LH分离株的抗生素敏感性。4.建立PFGE和ERIC-PCR分型的实验条件,对分离株进行PFGE和ERIC-PCR分型；采用BioNumerics v4.0软件中的非加权配对算数平均法(UPGMA)进行聚类分析,分析菌株的亲缘关系。5.PCR扩增法检测LH分离株中的整合酶基因及基因盒,对基因盒进行测序及比对分析。研究结果1.LH的鉴定程序的优化尿素酶、三糖铁、触酶、氧化酶及精氨酸双水解酶试验的灵敏度均达100%,而尿素酶试验的特异度、阳性预测值最高,分别为91.4%和72.2%。针对16S rDNA-PCR设计的引物具有100%的特异度,对于非LH目标菌扩增均呈阴性结果,未发现假阳性。尿素酶试验与16S rDNA-PCR结合检测LH时,Kappa值最高,为0.795。2.广州市淡水产品中LH的检测情况2.1从2008年10月至2009年9月,在广州市5个肉菜市场,共采集590份水产品的全肠样本,在590份样本中,鱼类标本390份,占66.1%,在这390份标本中,共有69份样本分离出LH,总阳性率为17.7%(69/390)。仅在草鱼和鳙鱼中检测到LH,草鱼LH的阳性率为28.1%(66/235)；鳙鱼的阳性率为11.1%(3/27)。其余的6个品种的淡水鱼均未检出LH。食用蛙标本包括6个品种,共200份(占总标本的33.9%),总阳性率为49.5%(99/200)。食用蛙阳性率高于淡水鱼(49.5% vs 17.7%,χ2=65.673,P<0.001)。本研究中6个品种的食用蛙均检出LH,但阳性率差异较大(χ2=14.476,P=0.013),阳性率从高到低依次为沼蛙(26/41,63.4%)、饲养虎纹蛙(43/75,57.3%)、黑框蟾蜍(7/15,46.7%)、牛蛙(10/22,45.5%)、野生虎纹蛙(11/37,30.0%)、棘胸蛙(2/10,20.0%)。2.2不同季节采集的草鱼标本中,LH的检出率差异有统计学意义(χ2=31.381,P<0.001)。各季节阳性率依次为：春季(28/60,46.7%),夏季(20/60,33.3%),秋季(13/35,37.1%),冬季(5/80,6.3%)。3.LH分离株的耐药分析3.1本研究共分离到199株LH,分离株对10类常用抗生素(青霉素类、头孢菌素类、其它β-内酰胺类,氨基糖甙类、喹诺酮类、四环素、氯霉素、红霉素、磺胺类、利福平)中的19种药物均表现不同程度的耐药。耐药率从高到低排列依次如下：头孢噻吩(99.5%),头孢唑啉(97.0%),利福平(74.9%),头孢哌酮(61.8%),氨苄西林(59.8%),红霉素(22.2%),四环素(18.1%),头孢他啶(12.6%),复方新诺明(12.1%),哌拉西林(10.1%),环丙沙星(6.5%),氨曲南(6.0%),链霉素(5.6%),头孢呋辛(4.5%),头孢吡肟(4.5%),氯霉素(3.5%),亚胺培南(2.0%),阿米卡星(2.0%),庆大霉素(0.5%)。所有分离株均发现对头孢菌素类抗生素表现耐药,大多数对第一、三代头孢菌素(头孢他啶除外)表现耐药,而对第二、四代头孢菌素表现较低的耐药率。129(64.8%)株LH对3个种类及以上的抗生素表现耐药(多重耐药)。3.2蛙源株对以下4种抗生素的耐药率均高于鱼源株：环丙沙星(12.1% vs 1.4%,χ2=6.486,P=0.011)、四环素(27.3% vs 10.1χ2=7.389,P=0.007)、复方新诺明(21.2% vs 2.9%,χ2=11.541,P=0.001)和利福平(83.8% vs69.6%,χ2=4.823,P=0.028)。7.1%的蛙源株对氯霉素类抗生素表现耐药,但全部鱼源株对其表现敏感。3.3 8种LH检测阳性的淡水产品中LH菌株的多重耐药率比较,差异有统计学意义(χ2=156.471,P<0.001)。多重耐药率从高到低排列依次如下：鳙鱼(4/4,100.0%)、牛蛙(10/12,83.3%)、饲养虎纹蛙(37/52,71.2%)、草鱼(52/76,68.4%)、野生虎纹蛙(8/13,61.5%)、黑框蟾蜍(5/11,45.5%)、沼蛙(11/26,42.3%)、棘胸蛙(2/5,40.0%)。4. PFGE和ERIC-PCR分型实验条件的建立4.1适合LH的PFGE条件为菌液的OD600值为1.8,细胞裂解4h, Spel20U酶切20h,电泳脉冲时间为2.2-54.2s,脉冲角度为120°,电场强度为6V/cm,电泳25h。4.2 DNA提取试剂盒提取DNA的纯度优于CTAB法和直接裂解法,可保证ERIC-PCR指纹图谱的有很好的显示效果；ERIC1和ERIC2联用较单用ERIC2得到的图谱清晰；退火温度为48℃时,图谱条带最清晰,数目适宜。5. LH分离株的PFGE分型PFGE重复性高,按菌株编号顺序每隔9株LH抽取1株,用相同的试剂、仪器和参数在不同时间实验得出的指纹图谱相同。限制性内切酶SpeI把基因组酶切成8-13条条带,分子量在50kb-500kb之间。以40%的相似度为界线,把相似度大于40%的菌株划分为同一个簇,共分为17个簇；再以80%相似度为界线,把相似度大于80%的菌株划分为同一个基因型,共分为161个基因型。分辨率(Simpson’s index of discrimination, SID)达99.7%。其中大部分基因型(137个)为1个基因型对应1个菌株,剩下24个基因型分布在余下的62株菌中。在161个基因型中,77株鱼源株占53个基因型,122株蛙源株占108个基因型。6. LH分离株的ERIC-PCR分型ERIC-PCR分型重复性好,每1个菌株重复1次得出的指纹图谱相同。用ERIC1和ERIC2扩增PCR产生5-10条条带,分子量在200bp-2000bp之间。同样,以40%的相似度为界线,把相似度大于40%的菌株划分为同一个簇,共分为19个簇；把相似度大于80%的菌株划分为同一个基因型,共分为135个基因型,SID达99.5%。其中,有109株LH(占54.8%)划分入45个基因型(E1-E45),其余90株LH(占45.2%),1株菌对应1个基因型(E46-E135)。在135个基因型中,77株鱼源株占49个基因型,122株蛙源株占86个基因型。7.耐药谱、PFGE、ERIC基因型之间的关系7.1从各种淡水产品中分离获得的LH经过PFGE分型,表现相当高的种内基因多态性。某些从不同品种的淡水产品分离获得的LH具有相同的PFGE基因型,但表现不同的ERIC基因型,如菌株W548(分离自野生虎纹蛙)和菌株Y37(分离自草鱼),而菌株W339(分离自牛蛙)和菌株Y258(分离自草鱼)具有相同的ERIC基因型,但表现不同的PFGE基因型。所有菌株中,具有相同耐药谱的菌株的基因型不相同,而具有相同基因型菌株的耐药谱也呈多样性。虽然在15份淡水产品中,每份标本检出超过1株LH,除菌株Y330和Y336外,它们都具有不同的PFGE和ERIC基因型。7.2耐药谱、PFGE、ERIC基因型之间基本上不能互相对应,80.9%具有不同PFGE基因型的LH菌株,也具有不同的ERIC基因型。19.1%的LH菌株虽产生相同的PFGE基因型,但产生不同的ERIC基因型。然而47.6%的LH菌株不能被ERIC区分,却可以被PFGE辨别。8.PCR法检测LH分离株中的整合酶基因及基因盒检测199株LH分离株,共有13株(6.5%)LH的一类整合酶基因(intI1)检测阳性,没有检测到二类整合酶基因(intI2)。其中,12株来源于食用蛙,只有1株来源于鳙鱼。在这13株intI1阳性的LH中,运用intI1基因的保守区域CS端设计的引物,扩增整合子中间的可变区域。PCR扩增出约1000bp、1500bp、3000bp大小的基因盒。9.基因盒测序及比对分析测序比对分析得出5种不同的基因盒及排列如下：dfrA1-orfC, aadA1-dfrA1, dfrA17-aadA5, dfrA14-arr2-cmlA5, dfrA32-ereA-aadA2。菌株W10,W24,W208,W280, W358, W490, W496产生约1100bp的PCR产物,包含dfrA1-orfC基因盒。GenBank比对分析,该序列与沙门氏菌(登录号为AY963803)相似度达99%。其中,dfrA1基因编码甲氧苄啶二氢叶酸还原酶,而orfC基因编码一个未知功能的蛋白。菌株W339和W350扩增的产物约1500bp,包含aadA1-dfrA1基因盒。GenBank比对分析,该序列与沙门氏菌(登录号为AY123251)相似度达93%。其中aadA1基因编码氨基糖甙腺苷酸转移酶,dfrA1基因编码甲氧苄啶二氢叶酸还原酶。菌株W400和W424同样扩增出约1500bp大小产物,包含dfrA17-aadA5基因盒。GenBank比对分析,该序列与大肠杆菌(登录号为GU055937)相似度达100%。其中dfrA17基因编码甲氧苄啶二氢叶酸还原酶,aadA5基因编码氨基糖甙腺苷酸转移酶。菌株W64产生约2800bp产物,包含dfrA14-arr2-cmlA5基因盒。GenBank比对分析,该序列与大肠杆菌(登录号为AM932674)和沙门氏菌(登录号为GU067640)相似度达99%。依次编码对甲氧苄啶、利福平、氯霉素耐药的蛋白酶。而唯一的1株来源于鳙鱼的分离株Y142,扩增出约2900bp大小产物,包含dfrA32-ereA-aadA2基因盒。该序列与沙门氏菌(登录号为GU067642)相似度达99%,依次编码对甲氧苄啶、红霉素、氨基糖甙类抗生素耐药的蛋白酶。值得注意的是,在这13株整合子阳性的LH分离株中均存在编码甲氧苄啶耐药的基因(dfrA1, dfrA14, dfrA17, dfrA32)。10.整合子与抗生素敏感性的关系对6种抗生素(头孢吡肟、环丙沙星、庆大霉素、四环素、复方新诺明和利福平),携带整合子的LH菌株的耐药率高于非携带株：头孢吡肟(61.5% vs0.5%,χ2=104.709,P<0.001)；环丙沙星(30.8% vs 4.8%,χ2=13.381,P<0.001)；庆大霉素(7.7% vs 0,χ2=5.531,P=0.019)；四环素(69.2% vs 14.5%,χ2=24.549,P<0.001)；复方新诺明(84.6% vs 7.0%,χ2=69.036,P<0.001)；利福平(100.0% vs 73.1%,χ2=4.667,P=0.031)。而非携带株对氨苄西林的耐药率高于携带株(62.9% vs 15.4%,χ2=11.413,P=0.001)。对其余12种抗生素的耐药率,携带株与非携带株间差异均没有统计学意义。13株整合子携带株均为多重耐药株,在整合子携带的基因盒上没有发现完全与菌株耐药性表现一致的耐药基因盒。11.整合子阳性分离株的PFGE指纹图谱分析13株整合子携带株的全基因组由限制性内切酶SpeI酶切成8-13个条带,分子量在50kb-500kb之间。按相似度大于60%划分为同一个簇,分为4个簇(A-D)；把相似度大于80%划分为同一个基因型,分为11个基因型。菌株的基因型与所携带的基因盒没有呈现明显的关系。例如,一些含有dfrAl基因的菌株,含有不同的PFGE基因型。即使含有相同整合子,从相同品种、采样市场、采样时间分离获得的LH菌株,都具有不同的PFGE基因型,如菌株W490和W496,W339和W350,W400和W424。相反,W64和Y142虽同属于PFGE指纹图谱中的A簇,却携带不同的耐药基因盒。研究结论1.用尿素酶试验筛选LH菌株具有很高的灵敏度、特异度和阳性预测值,是合理的首选生化试验。2. 8种淡水鱼中仅草鱼与鳙鱼检出LH,草鱼的阳性率为28.1%(66/235),鳙鱼为11.1%(3/27)。春季草鱼标本的LH检出率最高,最低为冬季。3.首次报道中国内地6种食用蛙携带LH,其中牛蛙、沼蛙、黑框蟾蜍、棘胸蛙携带LH未见文献报道。总阳性率达49.5%(99/200),沼蛙阳性率最高,最低为棘胸蛙。4.食用蛙LH检出率高于淡水鱼。5.所有的菌株至少对1个种类的抗生素表现耐药。大部分分离株对第一、三代头孢菌素(头孢他啶除外)表现耐药,而对第二、四代头孢菌素表现较低的耐药性。约2/3的分离株为多重耐药株。6. PFGE和ERIC-PCR分型方法具有高重复性、高分辨率,均可作为LH菌株的基因分型工具,以PFGE分型效果更好。7.从淡水产品分离的LH菌株,不仅耐药谱型多样,而且具有丰富的PFGE和ERIC基因型,表现相当高的种内基因多态性。8. 13株LH分离株intl1阳性,并携带5种不同的基因盒：dfrA1-orfC, aadA1-dfrA1, dfrA17-aadA5, dfrA14-arr2-cmlA5, dfrA32-ereA-aadA2,其中dfrA14-arr2-cmlA5是新发现的基因盒排列。9.一类整合子在LH获得对复方新诺明耐药性上起重要作用。而该菌对其它抗生素的耐药性获得与携带的整合子的关系不密切。10.整合子携带株的PFGE基因型均不一样,表现高度的遗传多态性。