柑橘属植物叶抗奶牛乳腺炎的机制研究

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目的:通过研究柑橘属植物叶对奶牛乳腺上皮细胞炎症模型的干预,对金葡菌的体外抑制作用,对自由基的体外清除能力,探讨其抗奶牛乳腺炎的作用机制。方法:(1)采用MTT比色法考察不同品种柑橘属植物叶对奶牛乳腺上皮细胞(Bovine epithelial mammary cells,BMECs)的毒性作用及对细胞发生炎症后的细胞活力的影响。利用金葡菌致炎蛋白构建炎性奶牛乳腺上皮细胞模型,提取各实验组BMECs总RNA,测定TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、ACACA、FASN、CSN2、CSN3等8种细胞因子的基因表达情况;测定在柑橘属植物叶干预下,TNF-α、IL-1β、IL-6、NO等4种炎症细胞因子的表达水平。(2)采用微量肉汤稀释法测定不同品种柑橘属植物叶对金葡菌(Staphylococcs aureus,S.aureus ATCC 29213)的最低抑菌浓度,考察各样品的体外抑菌能力。(3)通过测定对自由基DPPH·和O2ˉ·的清除能力,考察不同品种柑橘属植物叶的体外抗氧化能力;构建柑橘属植物叶的共有HPLC色谱条件,获取各样品的HPLC化学表达谱,进行聚类分析,并结合体外抗氧化数据,采用逐步回归法解析“谱-效”关系。结果:(1)不同品种柑橘属植物叶对炎症细胞模型的干预作用有明显差异。红橘叶的抗炎作用最强,能抑制主要炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β基因的表达;显著提高SOD基因的表达水平,其它样品的抗炎作用未表现一致性,且部分样品对炎性基因的影响不具有统计学意义(P>0.05);红橘叶不能增加乳汁成分ACACA、FASN、CSN2、CSN3基因的表达,部分杂交品种及柚类能显著促进CSN2、CSN3基因的表达(P<0.05)。(2)柑橘属植物叶对S.aureus ATCC 29213的抑菌能力有较大差异,红橘叶抑菌效果明显,在浓度为29.6813mg/ml时能完全抑制细菌的生长。其余样品的体外抑菌能力较弱。(3)体外抗氧化实验中,柑橘属植物叶对DPPH·的清除能力及对O2ˉ·的清除能力分别为2.08%~29.06%、0.4%~14.45%。HPLC图谱显示样品的化学表达谱信息丰富,同一大类样品有较高的相似度,不同大类之间区别较明显;分别筛选出了对清除DPPH·和O2ˉ·贡献最大的6个化学成分。结论:柑橘属植物叶在抗炎、抗菌及抗氧化方面均未显示较明显效力,说明该三种机制并非是其防治奶牛乳腺炎的主要原因。所有样品中,红橘叶的抗炎及抗菌作用略优于其他品种,显示出传统柑橘品种的优势,也提示选择药源时应充分考虑品种因素。
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