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前言 p15基因定位于人类染色体9p21，是一种肿瘤抑制基因，特异性地抑制细胞周期素依赖激酶4／6（CDK4／6），阻止细胞进入增殖周期。p15基因在多种人类肿瘤细胞中均有缺失或突变，近两年的研究更发现5’CpG岛的高度甲基化是其在血液系统恶性疾病尤其是白血病中的主要失活方式，而且发生率也比较高。甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation-specific PCR，MSP）方法，为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。我们应用MSP方法检测了p15基因在40例急性白血病、11例骨髓增生异常综合征、5例慢性粒细胞性白血病、13例非霍奇金淋巴瘤和7例多发性骨髓瘤患者中的甲基化状态，并分析了p15基因呈甲基化的急性非淋巴细胞白血病（ANLL）和骨髓增生异常综合征（MDS）患者的临床特点，从临床角度探讨恶性血液病的发生、发展与p15基因甲基化的关系，为更深层次的研究及临床的实际应用奠定基础。 实验方法 研究对象为急性白血病40例，骨髓增生异常综合征11例，慢性粒细胞性白血病5例，非霍奇金淋巴瘤13例，多发性骨髓瘤7例。标本取自患者的外周血，12名正常对照为健康自愿献血者，已知p15基因甲基化的细胞株Raji为阳性对照。外周血提取单个核细胞后，按照常规的蛋白酶k消化，苯酚-氯仿-异戊醇抽提，无水乙醇沉淀的方法提取DNA。将DNA用NaHSO3处理：取DNA2.5μl溶于12.5μl水中，加入0.4mmol／L NaOH 12.5μl，37℃10分钟；再加入10mmol／L C6H6O2 15μl及3mol／L PH5的NaHSO3260μl，液体石蜡覆盖（隔离空气），在50℃孵育16小时反应后冷 冻除去液体石蜡。加入 smM NaAc 4t4小时，0．smM C。H。O。4℃·4／J’时，0．SM NaAc 4t过夜，用蒸馏水4T 4 ／J’时洗两次，溶于 50…水中4℃过夜。加人等体积的0．6moUL NaOH，室温5分钟， 再加人等体积6moUL NH杠c及2倍体积预冷的无水乙醇，－20℃ 过夜，12000r／forn离心10分钟，得DNA沉淀，加人体积分数为 70％的冷乙醇，12000r／min离心 10分钟，洗2次，弃上清，得DNA 沉淀，吹干，30NI去离子水溶解DNA，－20T保存待做PCR。PCR 反应体系为50卜1，含 10 x缓冲液问．6mM硫酸镀／67mM TisJH 8．8／6．7mM MgCI。／10mM 2一流基乙醇)，dNTWpl，弓物为甲基化 引物 p15M或非 甲基化引物 p15U 0．5卜1，NaHSO。处理的 DNA 4pl，DNA聚合酶0．Zpl。扩增条件：96℃预变性5分钟，95℃30 秒，60℃30秒，72℃30秒，进行35个循环，最后一个循环72T延伸 7分钟。每次扩增均设对照。将MSP产物与上样液按6J混合， 于8％中性聚丙烯酸胺凝胶上电泳，紫外分析仪下观察，拍照。用 引物P15M有扩增产物，而用P15U无扩增产物为完全甲基化(＋ 十人用＂l5M与＂l5U均有扩增产物为部分甲基化(十人用n15U 有扩增产物，而用P15M无扩增产物为未甲基化(一人统计学处 理采用两样本均数比较的t检验及四格表确切概率法检验。 实验结果 初治或复发的急性白血病患者MSP阳性率为62．2％(37例 中 23例为阳性人其中急性非淋巴细胞白血病为 77．3％(22例 中间例为阳性人急性淋巴细胞白血病为40％(15例中6例为 阳性人两型间差异无显著性(P＞0．05，／＝3．SO人完全缓解 期的1例急性非淋巴细胞白血病为MSP阳性。骨髓增生异常综 合征阳性率为 36．36％(11例中 4例阳性人 5例慢性粒细胞性 白血病患者均表现为阴性。非霍奇金淋巴瘤阳性率为30．8％( 13例中4例阳性太多发性骨髓瘤阳性率为42．9％（7例中3例 ·2·阳性人 讨 论 P15基因常通过缺失而在包括白血病在内的多种人类肿瘤中失活，近年的研究发现，位于P15基因启动子和转录起始区的CPG岛高度甲基化是使该基因失活的另一主要方式。本实验中采用MSP方法对几种不同类型的恶性血液病的… 基因 CpG岛甲基化异常进行了研究，结果显示：正常对照全部处于未甲基化状态，表明… 基因CPG岛甲基化是白血病等恶性血液病肿瘤细胞所特有的。急性白血病… 基因甲基化阳性率为62．2％橱7例中有23例人急非淋和急淋二型之间阳性率无显著差异；在白血病完全缓解期有… 基因甲基化提示该抑癌基因仍处于失活状态，利于白血病细胞克隆的生长，预示着患者将来有复发的倾向；对24例ANLL患者临床资料的分析发现，有p15基因甲基化者比未甲基化者有较高的外周血白细胞计数和骨髓原始／早）幼细胞百分比。骨髓增生异常综合征患者甲基化检出率为 36．36％＊二例中4例阳性人低危组中甲基化发生率明显低于高危组且甲基化模式是部分甲基化，而高危组中全部有甲基化改变且是完全甲基化，似乎提示了… 基因的甲基化是在骨髓增生异常综合征和急性白血病的进展过程中发生并渐进性积累。慢性粒细胞性白血病无甲基化发生，