癫痫是中枢神经系统严重危害人类健康的常见病和多发病之一,对该病如何有效地防治是当今神经领域研究的一个热点。由于癫痫发生机制复杂,长期以来对其防治的研究未取得突破性进展。我们以前的研究结果和文献报告均证实,在癫痫发生发展的过程中,存在神经、免疫、内分泌等因素的异常和相互调节的紊乱,由此首次提出了“神经-免疫-内分泌网络失衡与癫痫发生有关”的学说,并认为以神经因素为主,免疫和内分泌因素在受体、信使和基因表达水平发挥调控作用,为癫痫的综合防治开拓了一条新的路径。因此,有效调控神经-免疫-内分泌网络的平衡,对癫痫发生和复发的防治具有重要意义。以前的研究工作多是从单个方面述及神经或免疫或内分泌因素与癫痫发病的关系及其防治作用,并未从整体水平(或神经-免疫-内分泌整个网络)及其相互作用方面阐述与癫痫发病的关系及防治,导致其防治效果并不理想。基于此,我们认为在对癫痫进行有效防治时,不能只注重对单一因素的干预,要想取得满意的防治效果,就要从不同的层面对多个因素进行干预。氯喹为一种传统的抗疟疾药。新近的研究证实其药理作用非常广泛,如通过与DNA结合抑制细胞的分裂增殖、抑制人单核巨噬细胞系统细胞因子的合成与分泌、抑制蛋白质的合成及一些酶的活性、与CaM结合后影响钙调蛋白及其效应酶活性等。另由于其影响进入DNA复制途径和基因表达途径中的一些酶的活性,从而影响DNA的复制和基因的转录。基于上述药理作用,氯喹已被用于几种与免疫及增生有关疾病的防治(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等),并取得了令人满意的结果,有些尚在临床评估过程中(如AIDS)。新近已有用于神经系统疾病的基础研究报道(如神经脱髓鞘变性疾病)。那么氯喹对癫痫的发生发展是否有干预作用呢?迄今为止,文献中尚未见有关报道。为验证这一假设,我们设计试用氯喹作干预剂,观察其对戊四氮(PTZ)致痫大鼠模型的作用,试图解答:(1)氯喹对星形胶质细胞(astrocyte, Ast)增殖活性的影响;(2)氯喹对脑内谷氨酸(glutamate,Glu)、N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NMDAR1,NR1)信号传导通路的干扰作用;(3)氯喹对脑内白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)表达的抑制作用;(4)氯喹对脑内雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)表达的干预作用;(5)氯喹对脑内钙调蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ)表达的影响。期望对癫痫的综合防治和发病机制的阐明提供有实用价值的基础研究资料。本论文共分6个部分,第1~5部分的实验设计和实验结果如下:实验用SD雄性大鼠48只,随机分为对照组(12只)、PTZ致痫组(18只)和氯喹干预组(18只)。PTZ致痫组经腹腔注射PTZ(60mg/kg)致痫,氯喹干预组预先在侧脑室注射氯喹6μl(0.61mg/kg),2h后腹腔注射PTZ致痫,对照组侧脑室注射生理盐水6μl。然后观察记录3组大鼠的行为表现,参照Smialowski的评估标准分为6级,并在注射后2h内分别记录大脑皮质和海马的脑电变化。4%的多聚甲醛灌注,恒冷箱(-20℃)切片机作额状切片,用免疫组化做胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、增殖细胞核抗原(proliferation cell nucleus antigen, PCNA)、Glu、NR1、IL-1β、TNF-α、ER、PR和CaMKⅡ标记;Western blotting检测皮质和海马Cyclin D1、NR1、TNF-α、ER和CaMKⅡ的含量。结果用图像分析系统作半定量分析。结果显示:(1)行为表现:对照组无痫样发作,PTZ致痫组痫样发作重(Ⅳ~Ⅴ),氯喹干预组发作轻(多在Ⅰ~Ⅲ级)(P <0.01);(2)脑电记录:对照组无痫样放电,PTZ致痫组呈典型的痫样波,氯喹干预组表现为慢波和小棘波;(3)GFAP、PCNA和Cyclin D1在PTZ致痫组的星形胶质细胞表达明显增强,氯喹干预组无明显增强趋势(P <0.05);(4)Glu和NR1在PTZ致痫组表达明显增强,与对照组比较差异有显著性(P <0.05),氯喹干预组无明显增强;(5)IL-1β和TNF-α在PTZ致痫组脑内表达明显增加,与对照组比较差异有显著性(P <0.05),氯喹干预组无明显变化(P >0.05);(6)ER在PTZ致痫组脑内表达明显增强,PR表达明显降低,与对照组比较差异有显著性(P <0.05),两者在氯喹干预组与对照组的比较无明显变化(P <0.05);(7)CaMKⅡ在PTZ致痫组、氯喹干预组和对照组脑内的表达未见明显差异(P >0.05)。根据对上述实验结果的分析,初步得出如下结论:(1)氯喹抑制PTZ致痫大鼠的痫样发作和痫样放电;(2)氯喹对胶质细胞增殖活性有抑制作用;(3)氯喹通过不同途径、多个环节对Glu、NR1信号传导通路的激活进行干预,从而影响癫痫的发生和发展;(4)氯喹抑制脑内IL-1β和TNF-α的合成与分泌;(5)氯喹通过对雌激素合成过程中P450芳香化酶活性的抑制而减少雌激素的合成,增加孕激素的产生,从而降低雌激素-ER信号传导通路的活性,增强孕激素-PR信号传导通路的活性,抑制由性激素介导的痫样发作。(6)氯喹通过对CaMKⅡ活性的干预发挥抑痫作用。氯喹抑痫的机制可能是通过:(1)氯喹与DNA二级结构结合,干扰了DNA的复制;(2)其能升高溶酶体和高尔基器网泡内的pH值,抑制一些酶的活性,包括酸性水解酶、蛋白质修饰酶等,从而影响翻译后新合成蛋白质的修饰;(3)氯喹通过升高核内体内的pH值,干扰Fe2+从转铁蛋白的解离,导致细胞内铁的浓度降低,影响进入DNA复制途径和基因表达途径中几种酶的活性,从而影响DNA的复制和基因的表达;(4)氯喹与CaM之间通过缩水作用和静电作用而结合,影响钙调蛋白及其效应酶的活性,细胞Ca2+内流减少,降低组织的兴奋性,抑制痫样发作和痫样放电;(5)氯喹通过抑制IL-1β和TNF-α的合成与分泌,降低了免疫因素在癫痫发病中的作用而发挥抑痫作用;(6)氯喹通过抑制雌激素代谢过程中P450芳香化酶的活性,影响由雌、孕激素介导的脑的兴奋性。综上所述,我们认为氯喹可能通过对神经、免疫、内分泌等因素的调控,发挥其抑痫作用,这些作用可能在综合防治癫痫的发生发展和复发及癫痫发病机制的阐明方面具有重要的理论和临床实用价值。第6部分:研究星形胶质细胞(astrocyte, Ast)与神经元之间信号交流的分子机制。用马桑内酯(coriaria lactone,CL)激活的星形胶质细胞条件培养液(astrocyte contined medium,ACM)对大鼠脑内Glu及其GluR2表达的影响作了观察。把培养的Ast ACM分为对照组(不加任何刺激因素)和CL激活组(2.5×10-5mol/L),激活2h后收集培养液,然后用于在体侧脑室注射实验。40只成年健康雄性SD大鼠,随机分为对照组(8只,注射未加刺激物的ACM 10μl)和CL组(注射CL激活的ACM 10μl),按注射后的时间分为2h、4h、8h和12h(每个时间点8只)。然后观察两组大鼠的行为表现,用免疫组化和免疫荧光检测脑内Glu和GluR2表达的变化,Western blotting检测脑内GluR2含量的变化。结果显示,侧脑室注射CL激活的ACM的大鼠有痫样发作,而对照组无痫样发作;免疫组化和免疫荧光检测结果显示,Glu在注射CL激活的ACM组的皮质和海马表达较对照组增强(P <0.05),而GluR2在皮质和海马表达较对照组减弱(P <0.05)。Western blotting对两组脑内GluR2的检测结果与免疫组化和免疫荧光检测结果类似(P <0.05)。根据对上述实验结果的分析得出如下结论:CL激活的ACM促进脑内Glu的表达,降低GluR2的表达,激活神经细胞的AMPA受体,使Ca2+通道开放。这些结果为阐明Ast与神经元之间信号交流的分子机制提供了实验依据。