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磷脂酶D作为磷脂酰基转移反应的催化剂,广泛应用于催化合成各种功能性磷脂产品,因此倍受关注。制备得到催化活力高、操作简便、保存稳定性好的固定化酶是磷脂酶D应用研究的关键课题。本文在前序工作的基础上,以酶分子交联为核心,尝试采用吸附-交联、吸附-聚集-交联、以及无载体的聚集交联三种方法对磷脂酶D进行固定化,研究酶固定化的操作条件、固定化磷脂酶D的性能,为酶固定化方法和磷脂酶D应用研究提供依据。以实验室筛选保藏的链霉菌菌株发酵生产磷脂酶D,研究酶的初步分离纯化工艺。结果表明,发酵液离心所获得的粗酶液经硫酸铵-乙醇协同沉淀纯化后,比活力可达10.45U／mg,纯化倍数达11.32倍,分离纯化的酶活力回收率达87%。这为固定化研究提供了良好的酶来源。吸附与交联相结合是对游离酶进行载体固定化的常用方法。本文首先采用吸附-交联法探索PLD的固定化。以微晶纤维素、硅藻土、多孔硅胶作为载体,戊二醛作为交联剂。研究表明,硅藻土吸附效果最好；以其为载体的最优吸附-交联固定化条件为：酶液(比活力为：10.45 U／mg)与载体比例：4：1(mL／g),吸附时间为3h,戊二醛浓度为1.5%,交联时间为3h。最优条件下,酶活力回收率为65%,固定化磷脂酶D的活力为5.56U／mg。酶固定化回收率低、载酶量有待提高。基于沉淀剂作用下酶分子相互聚集、溶解度降低,被载体吸附趋势增加的考虑,提出以沉淀聚集作用促进酶的吸附-交联固定化,即进行酶的吸附-聚集-交联固定化的研究方案。沉淀剂分别采用硫酸铵、乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、甲醇、PEG6000；交联剂为戊二醛。沉淀过程对酶稳定性的影响通过沉淀-复溶法评价,乙醇引起的活力损失率最小,沉淀-复溶的活力回收率达91%。通过单因素考察及响应面分析,优化了吸附-聚集-交联固定化的操作条件。硅藻土为载体、沉淀pH8.2、无水乙醇饱和度81.6%、戊二醛浓度2.87%、交联时间4h、载体与酶液(比活力为：10.45 U／mg)的比例1：4(g／mL)。磷脂酶D活力回收率达到89%,固定化酶活力为7.36U／mg。重复使用10批次后剩余活力为60%。新方法固定化磷脂酶D显著提高了固定化效率和操作稳定性。为了与沉淀-交联固定化的典型方法相比较,本文还尝试了以无载体的交联酶聚集体(CLEAs)技术固定化磷脂酶D。以乙醇为沉淀剂、戊二醛为交联剂,得到PLD-CLEAs的最佳条件：酶液浓度为0.2g-protein/mL(比活力为：9.5 U／mg),乙醇饱和度为72.6%,戊二醛浓度为0.22%,交联时间为1.8h。酶固定化最大酶活力回收率能够达到86%,固定化酶活力达到15.62 U／mg。重复使用10批次以后,相对酶活力保留55%。交联酶聚集体法固定化磷脂酶D取得与吸附-聚集-交联固定化相近的效果。以酶分子交联为核心,辅助沉淀作用可以较高的活力回收率实现磷脂酶D无载体交联聚集固定化和载体吸附-交联固定化,固定化酶稳定性良好。