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微卫星是广泛存在于原核及真核细胞基因组中的简单串联重复DNA序列，并具有高度多态性，变异率极低，以孟德尔共显性方式遗传。人类许多肿瘤的发生、发展与基因组特定微卫星DNA遗传的不稳定性(Microsatelliteinstability，MSI)及相应等位基因的杂合性缺失(Lossofheterozygosity，LOH)有关，某些特异染色体微卫星的LOH多同时伴有该位点上的抑癌基因失活，并在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。许多散发性肿瘤如白血病、膀胱癌、黑色素瘤、胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤中均发现有广泛MSI现象。现已证实高等真核细胞中存在错配修复基因系统(Mismatchrepairgenesystem，MMR)，参与复制后的修复，通过消除DNA合成的错误以保持DNA复制的稳定性和保真性；目前已知的MMR系统中土要包括6种基因，即hMLH1、hMSH2、hMSH3、hPMS1、hPMS2和hMSH6。当MMR.基因功能失活(如基因突变、启动子区甲基化)，就不能修复DNA复制过程中的错误，易导致微卫星DNA重复序列的不稳定性，表现为MSI和LOH。因此，对胶质瘤中微卫星不稳定性研究有助于认识胶质瘤发生、发展机制，更好揭示胶质瘤发病分子基础。 实验材料和仪器 1．实验材料：星形细胞瘤标本来自浙二医院神经外科手术标本，同时取患者外 浙江人学硕t研究生学位论文周静脉血作为正常组织DNA对照。试剂：蛋白酶K、TaqDNA聚合酶等购自丹麦＊＊＊O公司。氯仿、异戊醇、乙醇、醋酸钠等购自杭州长征化学试剂厂。2．实验仪器：恒温箱：宁波江南仪器厂。PCR电泳仪和超速离心机：北京六一仪器厂。紫外分光光度仪：上海分析仪器厂。 实验方法1．DNA的抽提 ①组织林本DNA的抽提：将组织碾碎后蛋白酶K消化，50oC孵育门～18小时。等体积酚／氯仿／异戊醇抽提 DNA，醋酸钠、乙醇沉淀，TE溶解，4 t保存。 ②血液标本DNA的抽提：蛋白酶K消化，50℃水浴中1小时。酚／氯仿／异戊醇抽提DNA，无水乙醇及醋酸钠沉淀，TE（3－羟甲基－氨基乙烷－乙二氨四乙酸）溶解，4℃保存。2．微卫星PCR扩增 选用Dgsl 71、DgS 65、D9554、APOCZ、D19SllZ、HRC等6个微卫星位点上仕1丁了不mll。u以卜日已n IVH勺l十U广卜yu人八LJCflOITICIna辽a0s e LflT［D：／／gQDWZ口口．Of ii2Q口／查获，引物山中科院上海细胞生物所合成。PCR反应体系为：50mmol／L KCL，10mmol／L Tris一CI，1．smol／L MgCI＊，200 u rnol几 dNTPs，模板 DNA 200ng，上下游引物各 50pmol，TaqDNA聚合酶 IU加水至 50 u L。PCR反应参数为：94oC变性smin，然后进入循环（94℃50秒，55aC 60秒，72℃60秒，）共35个循环，最后72oC延伸10min，4C保存。3．变性聚丙烯酚胺凝胶电泳 制备8％变性聚丙烯酚胺凝胶，取KR扩增产物IOUI，与等体积的变性加样缓冲液混合后于 95 aC变性 10min，冰上骤冷，取 15ul逐一上样。400V恒压电泳，根据指示剂二甲苯青的位置判断产物泳动位置。 一3 一 浙江大学硕士研究生学位论文4．银染显色 将带胶的玻璃板分别用 10％乙醇和 1％硝酸处理 smin，蒸馏水漂洗，用 0．2％硝酸银溶液染色 10min，蒸馏水漂洗后用 1．5％NaOH、0．4％甲醛溶液显色至带型清晰，照相用于结果分析。5．结果判断 分析电泳图谱，MSI定为肿瘤组织相对于正常组织出现条带的数量及大小的 改变。＊OH为肿瘤某一等位基因条带消失或相对密度减少50％以上。所有实验 数据利用 SPSS．0 FOR WINDOWS统计软件包进行处理。 结 果 本实验所采用6个微卫星位点的染色体位置及引物序列见表1。 46例星形细胞瘤的M剐分析表明：共有刀例存在Mm（47．8％）；LOH共有14例（30．40），其中I～11级3例（6．5O），Ill－IV级11例（23．9o），具体位点参见表二，可见肿瘤的恶性程度高低与＊OH的发生有显著差异（P＜0刀5），且 19号染色体的＊OH与肿瘤的恶性程度高低之间也存在显著差异（P＜0刀5）。 表1 微卫星引物序列及染色体位置 引物名称 引物序列5’－丁 染色体位置 5’。AGCTAAGTGAACCTCATCTCTGTCT3’ DgS171 gpterp22 5’，ACCCTAGCACTGATGGTATAGTCT3’ 5’－GACTTTGGCTGCTAGATGTG－3’ Dgsl65 gpZ19qZI 5’－CAGAGGAGTTACAAATATGACAGG－3’ 5’－GAAAGTCCAGAACTAAGTAG－3 ＊9％习 印21 5’－TGTGGATAGGTAWGC－3’ 5’，CATAGCGAGACTCCATCTCC－3’ APOCZ 19ql3二 5’－GGGAGAGGGCAAAGATCGAT3 5’－