瘙痒是一种能引起立即进行搔抓欲望的主观感觉。临床上,能够引起瘙痒的疾病有很多,包括皮肤病、癌症和系统性疾病等,心理因素也可导致瘙痒的产生。瘙痒可引起失眠、抑郁,甚至自杀倾向,这种症状不可忽视。在国外,难以治愈的顽固性瘙痒甚至可以成为肝移植手术的重要指征。在我国,瘙痒是肝胆系统疾病的常见和多发症状,但是胆汁淤积性肝病导致瘙痒的机制仍不清楚,如何治疗胆汁淤积性疾病伴发的瘙痒也是临床医生的难题。因此,探明胆汁淤积性瘙痒的细胞和分子机制将为探索有效的临床治疗方法提供科学依据。近年来的研究发现,胆汁淤积症患者除了出现瘙痒外,还有一个特征即痛阈明显升高,手术中吗啡消耗量明显减少。另外,研究者对胆汁淤积动物模型和胆汁淤积性瘙痒患者的研究发现,许多介质和受体参与并导致了瘙痒行为的发生。最近的研究发现,胆汁淤积症患者血清中溶血磷脂酸(lysophosphatidic,LPA)和自分泌运动因子(autotaxin,ATX)的升高可能是引起瘙痒的的一个关键因素。目前发现血清ATX与瘙痒程度相关,阻断ATX的产生对减轻瘙痒程度有效应。ATX将血清中的磷脂酰胆碱水解成胆碱基团和LPA。LPA通过LPA受体发挥作用,研究表明,到目前为止,LPA受体至少有6个亚型。根据我们以前的工作发现,LPA1受体亚型在正常小鼠和胆汁淤积小鼠的表达量都是最丰富的;另外,与正常小鼠相比,胆汁淤积小鼠的LPA4受体表达增加最为显著。根据现有文献,LPA1受体亚型在痛信号通路中起到重要作用。LPA4受体在胆汁淤积的情况下表达明显增高,提示LPA4受体可能在痒信号转导的过程中发挥重要功能。因此,我们这个课题着重研究这两种受体亚型在胆汁淤积性瘙痒中的作用。研究表明,痒神经元是脊髓的背根神经节内能表达胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)的中、小神经元,其中枢突起投射到脊髓的后角中的I层,与后角I层中能特异性的表达胃泌素释放肽受体的神经元形成突触联系,从而能将来自外周的痒信号向中枢传递,因此可以将脊髓的背根神经节(dosal root ganglia,DRG)中GRP表达阳性的神经元视作痒神经元。TRPV1是重要的介导疼痛产生的离子通道之一,外周的痛信号通过痛信号通路向中枢传递。正常情况下,痛信号通路占优势,痛信号通路发出侧支,通过中间抑制性神经元抑制痒信号的传递;但在胆汁淤积情况下出现痛行为下降而痒行为增多的现象。那么,胆汁淤积症患者痛阈的升高是否与TRPV1表达和功能的降低有关,从而成为瘙痒产生的机制之一是我们接下来要做的工作。因此,本课题通过胆总管结扎的方法建立小鼠胆汁淤积模型,利用“面颊模型”观察小鼠的擦拭行为和搔抓行为,通过行为学实验方法观察小鼠LPA1受体在胆汁淤积情况下的功能,以及lpa4受体在胆汁淤积病理情况下的功能。另外,我们应用westernblot技术、免疫荧光染色技术及单细胞膜片钳技术观察trpv1在胆汁淤积情况下的功能的变化及lpa对trpv1的作用。通过trpv1通道在胆汁淤积情况下的功能和表达的变化,lpa1受体在胆汁淤积情况下的功能改变,以及lpa4受体在胆汁淤积病理情况下的功能的研究,明确胆汁淤积时,lpa在瘙痒中发挥的作用及其发病机制。我们的研究不仅为探究lpa在慢性胆汁淤积性瘙痒的作用和机制提供新的科学依据,也为寻找治疗慢性顽固性胆汁淤积性瘙痒提供新的方法奠定基础。主要研究结果如下:一、胆汁淤积后lpa抑制了trpv1的功能。1、westernblot技术研究结果表明,胆汁淤积(bdl)小鼠trpv1的表达显著降低。2、单细胞全细胞膜片钳记录结果表明,胆汁淤积后背根节痒神经元trpv1激活诱发的内向电流显著降低。行为学实验研究结果表明,胆汁淤积后小鼠对trpv1激动剂辣椒素(capsaicin)诱发的痛样行为显著减少,搔抓行为没有明显的变化,提示胆汁淤积后trpv1的功能降低。3、单细胞全细胞膜片钳记录结果表明,在胆汁淤积小鼠,lpa显著抑制trpv1激动剂辣椒素(capsaicin)诱发的内向电流。行为学实验结果表明,小鼠尾静脉注射lpa后,trpv1激动剂辣椒素(capsaicin)引起的胆汁淤积小鼠痛样反应显著降低,表明胆汁淤积情况下,lpa抑制了trpv1的功能。二、抑制lpa1受体功能,增强瘙痒反应。1、免疫荧光染色技术研究结果表明,lpa1受体在痒神经元上表达,提示lpa1受体可能与瘙痒的发生有关。2、行为学实验结果表明,对sham小鼠应用lpa1受体特异性阻断剂ki16425抑制lpa1受体,可减轻lpa诱发的疼痛反应,并增加搔抓反应,提示抑制lpa1受体的功能可增强瘙痒反应。3、行为学实验结果表明,对sham和bdl小鼠应用lpa1受体相对选择性激动剂vpc31143(r)后,发现与sham组小鼠相比,胆汁淤积小鼠的痛样行为显著降低,提示胆汁淤积情况下,lpa1受体功能降低。三、激活lpa4受体功能,增强瘙痒反应。1、行为学实验结果表明,在sham小鼠,lpa主要诱发疼痛反应;而lpa4受体选择性激动剂vpc31144(s)诱发搔抓反应。2、行为学实验结果表明,在胆汁淤积小鼠,选择性激活lpa4受体引起显著的搔抓反应,提示LPA4受体可能介导瘙痒反应。3、行为学实验结果表明,LPA4受体选择性激动剂VPC31144(S)呈剂量依赖性诱发SHAM小鼠和BDL小鼠的搔抓反应。综上所述,我们的研究结果表明,在胆汁淤积的病理情况下,TRPV1的表达和功能下降,LPA抑制了TRPV1的功能;胆汁淤积后LPA1受体功能受到抑制;选择性激活LPA4受体诱发搔抓反应而不产生疼痛反应。这些结果提示,在胆汁淤积的情况下,LPA可能通过抑制TRPV1的功能以及LPA1受体功能的降低从而导致痛阈升高成为瘙痒的机制之一;此外,LPA4受体功能的增强可能是LPA直接诱发瘙痒的机制。