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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,其主要临床表现是记忆力、认知功能、人格及语言功能逐渐下降.AD有两个典型的组织病理学改变为老年斑(Senile plaque, SP)和神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFT),其中过度磷酸化的微管Tau蛋白于神经元内高度螺旋化是形成NFT的主要原因.目前对于AD的治疗方法主要以对症治疗为主,包括药物治疗和非药物治疗用以改善认知功能和控制精神症状,减少并发症,尚不能有效控制病程发展、治愈疾病。随着干细胞转化医学的发展,已有多种干细胞用于治疗AD的研究报道,显示出良好的效果和临床应用前景。但探寻更理想的种子细胞,仍然是AD干细胞治疗的重要课题.牙髓干细胞(Dental pulp stem cells, DPSCs)和牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是来源于神经嵴的牙源性干细胞,相比于脐带等中胚层来源的干细胞,具有更加明显的神经分化潜能,而且,DPSCs和PDLSCs具有可自体取材,免疫原性低等优点,在治疗神经系统疾病方面更具优势。目前体内和体外许多研究都证实DPSCs和PDLSCs能够帮助预防和修复神经损伤,而DPSCs在治疗帕金森、大脑损伤和脊髓损伤等中枢神经系统疾病方面已取得一定疗效,但它们对AD的治疗作用研究尚未见报道。本研究通过冈田酸(Okadaic acid, OA)损伤SH-SY5Y神经细胞系,建立AD体外细胞模型,在此基础上系统研究DPSCs和PDLSCs对AD细胞模型的治疗效果,以期为DPSCs与PDLSCs用于AD治疗提供理论和实验依据.研究的主要方法和结果如下：1.分别采用酶消化法和组织块法原代培养分离人DPSCs、PDLSCs和脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs),单细胞克隆培养纯化DPSCs和PDLSCs;倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8比较细胞增殖能力,流式细胞仪和免疫荧光染色检测细胞表面标志物。体外诱导这3种干细胞向成骨、成脂和成软骨方向分化,通过细胞形态变化、特异性染色(碱性磷酸酶、茜素红染色和Von Kossa染色,油红O染色,阿尔辛蓝和HE染色)分别鉴定诱导细胞成骨、成脂、成软骨分化能力,进一步实时荧光定量PCR检测比较3种细胞成骨相关基因OCN和RUNX2及成脂相关基因PPAR-γ的表达水平。结果显示：这3种间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)细胞形态略有不同,但细胞表面标志蛋白表达相似,均阳性表达CD166、CD105、CD44、CD73和CD90以及间充质细胞标记vimentin和α-SMA;而DPSCs和PDLSCs增殖能力显著高于UCMSCs;三者均可向成骨、成脂和成软骨诱导分化,但分化能力不同。成骨分化能力由强至弱依次为DPSCs、UCMSCs、PDLSCs;成脂分化能力DPSCs分化能力最强,UCMSCs次之,PDLSCs相对较弱；成软骨分化能力比较发现：与DPSCs相比,UCMSCs和PDLSCs分化能力更强。2.采用倒置相差显微镜观察和CCK-8检测不同浓度OA溶液与神经细胞系SH-SY5Y孵育24h细胞形态和细胞活性变化,确定建立细胞模型的最佳给药浓度。用确定的OA浓度(20nmol/L)孵育SH-SY5Y细胞系24h,建立细胞损伤AD体外模型.再通过倒置显微镜观察细胞形态、CCK-8检测细胞活性、Hoechst 33258荧光染色细胞凋亡率、激光共聚焦显微镜分析a-tubulin和鬼笔环肽特染的细胞骨架、透射电镜观察细胞微管结构以及蛋白免疫印迹分析细胞Tau蛋白磷酸化水平的变化。结果显示：筛选确定20nmol/L OA作用24h是建立AD细胞模型适宜的作用浓度和作用时间.从形态看,20nmol/L OA损伤SH-SY5Y细胞24h后,其细胞表面形态改变,细胞突触断裂消失；同时,细胞活性显著下降,凋亡率上升；微管、微丝结构明显改变,表现为树突退缩消失,微管塌陷疏松,微丝排列紊乱,含量明显降低,这些变化均与对照组有显著性差异,蛋白免疫印迹半定量分析结果也显示OA增强了细胞Ser 396位点磷酸化Tau蛋白水平.通过多角度、多层次观察分析,结果表明：20nmol/L OA损伤SH-SY5Y细胞24h所建立AD细胞模型是可靠的.3.采用Transwell小室及条件培养基共孵育的方式,分别研究DPSCs和PDLSCs对AD细胞模型的治疗作用。实验通过比较对照组、模型组和治疗组细胞形态、细胞活性、细胞凋亡率、细胞骨架、细胞微管结构及细胞内Tau蛋白磷酸化水平等指标来评价DPSCs和PDLSCs对AD细胞模型的治疗效果。研究结果显示：分别经DPSCs和PDLSCs治疗后,OA损伤的细胞形态逐渐恢复,回缩的树突重新伸长；细胞数量增多,活性增强；树突长度、细胞活性及细胞凋亡检测均显示治疗组与模型组结果有显著性差异。进一步激光共聚焦发现：治疗组树突粗壮较长,凋亡细胞少见,核形态圆而规则,显色均匀,类似对照组；α-tubulin、F-actin特染显示治疗组微丝致密规则,微管纤维变粗,结构与对照组无明显差异.透射电镜下可见治疗组细胞质内微管结构清晰、排列有序,与对照组相似。同时,蛋白质免疫印迹也发现治疗组细胞Tau蛋白的Ser 396位点磷酸化水平降低。这些结果表明：DPSCs和PDLSCs治疗OA损伤所致的AD细胞模型,从细胞形态、生物活性、微管结构及功能方面均显示良好的治疗效果。综上所述,本研究的结论是：(1)不同组织来源的MSCs具有不同的生物学特性,牙髓、牙周膜及脐带间充质干细胞在增殖和三系分化能力上存在差异；(2)20nmol/L OA诱导SH-SY5Y细胞系24h可建立可靠的AD样细胞模型,用于AD体外研究；(3)DPSCs和PDLSCs对OA诱导的AD细胞模型均有显著治疗作用,其机制与这两种细胞分泌的多种生长因子可拮抗Tau蛋白磷酸化有关。本研究结果表明DPSCs和PDLSCs作为牙源性MSCs用于治疗AD独具优势,为临床AD治疗提供了新思路、新方法,具有重要的科学价值和广阔的应用前景.