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目的:孕期咖啡因暴露可致宫内发育迟缓子代大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic pituitary adrenal,HPA)轴发育编程改变,表现为HPA轴低基础活性和高应激敏感性,其中HPA轴调控中枢——海马发育损伤可能是影响其发育编程改变的重要原因。本研究基于前期研究基础,重建孕期咖啡因暴露大鼠模型,探讨孕期咖啡因暴露所致子代海马神经元兴奋性损伤的宫内编程机制。方法:整体水平:受孕Wistar大鼠随机分成对照组、咖啡因小、大剂量组,咖啡因小、大剂量组从孕第9天(GD9)起每天给予30 mg/kg·d和120 mg/kg·d咖啡因灌胃直至GD20,对照组给予等体积的蒸馏水灌胃。于GD20麻醉孕鼠取胎鼠,留取海马组织液氮冷冻后于-80℃保存备用;部分胎鼠全脑固定包埋后制作冰冻切片及电镜切片。采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测胎鼠海马增殖、凋亡、突触可塑性相关基因以及 A2A腺苷受体(adenosine A2A receptor,A2AR)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/cAMP 依赖蛋白激酶(protein kinase A,PKA)通路、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)通路相关基因表达;ELISA法检测cAMP及PKA的含量;Western Blot法检测BDNF及谷氨酸脱羧酶67(glutamate decarboxylase,GAD67)蛋白表达;组织免疫荧光技术检测胎脑谷氨酸(glutamate,Glu)及y-氨基丁酸(y-aminobutyricacid,GABA)能神经元数目。细胞水平:大鼠胎海马H19-7/IGF1R神经元细胞系给予不同浓度咖啡因(1 μM、10 μM、100 μM)分别处理细胞 1 d、2 d、3 d,或给予 A2AR 激动剂 CGS21680(2 μM)、cAMP激动剂Forskolin(4μM)与咖啡因(1000μM)共处理细胞系3d,留取细胞及细胞外液。采用qPCR技术检测胎鼠海马增殖、凋亡、突触可塑性相关基因以及A2AR、cAMP/PKA通路、BDNF通路相关基因表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot法检测BDNF及GAD67蛋白表达;ELISA法检测细胞外液Glu、GABA含量及cAMP、PKA含量。结果:整体水平:①胎海马超微结构:与对照组相比,咖啡因组雌、雄胎海马神经元细胞胞质中细胞器减少、细胞线粒体肿胀和内质网扩张且伴有脱颗粒改变;②胎海马增殖、凋亡及突触可塑性基因:与对照组相比,咖啡因组雌、雄胎鼠海马CDK2表达显著降低(P<0.05,P<0.01),CyclinA表达无明显改变,Bax、caspase-3表达均显著升高(P<0.05,P<0.01),咖啡因大剂量组雌性胎鼠海马Bcl-2表达显著降低(P<0.01),且Bax/Bcl-2表达比值升高;咖啡因组雌、雄胎鼠海马NR1表达显著降低(P<0.05,P<0.01),NR2A表达显著升高(P<0.01),咖啡因组雌性胎鼠海马NR2B、SNAP25表达显著降低(P<0.05,P<0.01),且NR2A/NR2B表达比值升高,咖啡因组雄性胎鼠海马Synl表达显著降低(P<0.01);③胎海马Glu和GABA能神经元及GAD67表达:与对照组相比,咖啡因大剂量组雌、雄胎鼠海马神经元Glu能神经元数目显著降低(P<0.05,P<0.0l),GABA能神经元数目显著增加(P<0.05,P<0.01);咖啡因组雌、雄胎鼠海马GAD67的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.01);④胎海马A2AR、cAMP/PKA及BDNF通路:与对照组相比,咖啡因大剂量组雄性胎鼠海马A2AR表达显著降低(P<0.01),咖啡因组雌、雄胎鼠海马腺苷环化酶(Adenosine cyclase,AC)表达均显著降低(P<0.01),咖啡因组雌、雄胎鼠海马CREB、BDNF和TrkB表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);与对照组相比,咖啡因大剂量组雄性胎鼠海马cAMP和活性PKA含量均显著降低(P<0.01),且雌、雄咖啡因大剂量组雌、雄胎鼠海马BDNF蛋白表达均显著降低。细胞水平:①胎海马神经元增殖相关基因:与对照组相比,100 μM咖啡因处理细胞1 d、2d、3d时CDK2表达均显著降低(P<0.01),处理细胞2d、3d时CyclinA表达显著降低(P<0.01);不同浓度咖啡因处理细胞3d后,CDK2表达在各浓度咖啡组均显著降低(P<0.05,P<0.01),CyclinA表达在100 μM咖啡因处理组显著降低(P<0.05);②胎海马神经元凋亡相关基因及凋亡细胞数量:与对照组相比,100 μM咖啡因处理细胞1d、2d时Bax表达显著降低(P<0.01),处理细胞1d、2d、3d时Bcl-2表达显著降低(P<0.01),且Bax/Bcl-2比值升高,caspase-3表达显著升高(P<0.01);不同浓度咖啡因处理细胞3d后,Bax表达无明显改变,Bcl-2表达在10 μM、100μM咖啡因处理组显著降低(P<0.01),且Bax/Bcl-2比值升高,caspase-3表达在各浓度咖啡组均显著升高(P<0.01);流式结果显示,与对照组相比,100 μM咖啡因处理细胞3d后有凋亡趋势的细胞增加,且随给药时间(1d、2d、3d)延长凋亡细胞比例显著增加(P<0.01),不同浓度咖啡因(1μM、10μM、100μM)处理细胞3d时,凋亡细胞随着给药浓度升高而增加(P<0.05,P<0.01);③胎海马神经元突触可塑性基因:与对照组相比,100 μM咖啡因处理细胞1 d、2 d、3 d后NR1表达显著降低(P<0.01,P<0.05),NR2A表达在咖啡因处理细胞3d时显著升高(P<0.01),NR2B表达在咖啡因处理细胞2d、3d时显著降低(P<0.05,P<0.01),且NR2A/NR2B表达比值升高,Syn1、SNAP25表达均显著降低(P<0.01);与对照组相比,不同浓度咖啡因处理细胞3d后,NR1表达均显著降低(P<0.01),NR2A表达在10μM、100μM咖啡因处理组显著升高(P<0.01),而NR2B表达均显著降低(P<0.01),且NR2A/NR2B表达比值升高,Syn1、SNAP25表达均显著降低(P<0.01);④胎海马神经元Glu和GABA释放量以及GAD67表达:与对照组相比,不同浓度咖啡因处理细胞3 d后H19-7/IGF-IR神经元细胞Glu和GABA释放量均显著升高(P<0.01),且GAD67的mRNA和蛋白表达均显著升高;⑤胎海马神经元A2AR、cAMP/PKA及BDNF通路:与对照组相比,100μM咖啡因处理细胞3 d时AC表达显著降低(P<0.01),处理细胞1d、2d、3d时A2AR表达显著降低(P<0.01),处理细胞2 d、3 d时CREB表达显著降低(P<0.01),处理细胞1d、2d、3d时BDNF表达显著降低(P<0.01),处理细胞2d、3d时TrkB表达显著降低(P<0.05,P<0.01);不同浓度咖啡因(1μM、10μM、100μM)处理细胞3 d时AC、CREB、BDNF和TRKB表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);不同浓度咖啡因处理细胞3 d后cAMP和活性PKA含量均显著降低(P<0.05,P<0.01),且BDNF蛋白表达也呈浓度依赖性降低;⑥干预实验:CGS21680和Forskolin干预均可逆转咖啡因对CREB、BDNF及TrkB表达的抑制作用(P<0.01)。结论:孕期咖啡因暴露通过拮抗胎海马A2AR抑制cAMP/PKA通路,并进一步下调CREB/BDNF/TrkB通路活性,介导胎海马Glu兴奋性损伤改变;在此情况下海马GAD67代偿性上调,加速Glu向GABA的转化以减轻海马局部Glu兴奋性损伤;但GAD67的过度上调会导致胎海马Glu和GABA水平及信号输出失衡,损伤海马对下丘脑PVN的负反馈调节,最终介导了子代HPA轴高敏感性发生。