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恶性肿瘤是危害人类健康的主要慢性疾病之一,在祖国医学中,属"症瘕""积聚""岩""瘤""噎膈"等范畴。林洪生教授致力于中西医结合防治恶性肿瘤科研与临床近40载,认为肿瘤是整体属虚,局部属实的全身疾病的局部反应,"虚""毒""瘀"是肿瘤致病的主要病理因素。林洪生教授在全国中医肿瘤工作者对中医肿瘤病因病机,理法方药不断研究的基础上,继承总结既往"扶正培本"理论,并进一步凝练提出了更能针对肿瘤"虚" "毒" "瘀"致病特点的"固本清源"新理论。"固本"是顾护机体正气以扶正,提高患者的防病抗病能力,纠正正气不足的病理状态;"清源"是祛除肿瘤发生发展的致病因素,从源头上控制肿瘤。林洪生教授通过循证医学研究证实"固本清源"理论指导下的扶正活血解毒法可以延长晚期非小细胞肺癌患者的生存期,提高患者的生活质量,证实了该理论指导下的扶正活血解毒法治疗肿瘤的临床有效性。为了进一步明确固本清源理论的生物学内涵,以及探明扶正活血解毒中药对肿瘤的作用机制,林洪生课题团队以肿瘤微环境和肿瘤干细胞为切入点,对扶正活血解毒法指导下的中药干预肿瘤千细胞的生物学行为做了深入研究。在既往师兄师姐博士课题中,从"固本"和"清源"两方面证实扶正活血解毒中药复方对肿瘤干细胞生物学行为的调控作用。为了深入研究不同治则中药在"固本"和"清源"中医肿瘤理论中所扮演的角色,以及他们对肿瘤干细胞生物学行为的干预作用机制,课题组针对单一治则中药进行研究,目前已经初步证实活血中药、解毒中药对肿瘤干细胞在"清源"理论指导下的调控作用。但课题组仍未对扶正中药干预肿瘤干细胞的生物学行为做以系统研究,所以为填补课题组的研究空白,毕业课题特选用扶正中药人参的提取物人参皂苷Rh2(Ginenoside Rh2,GRh2)作为研究药物,以前列腺癌DU145细胞系干细胞作为研究对象,探索扶正治则代表中药人参的提取物GRh2对肿瘤干细胞生物学行为在"清源"理论方面的调控机制,以期进一步明确扶正活血解毒法对肿瘤发生发展的干预作用,在丰富固本清源理论科学内涵的同时,也为中医药多通路多靶点调控肿瘤干细胞提供实验室依据。研究目的:1.明确GRh2通过下调Notch1信号通路调控肿瘤干细胞生物学行为,进而抑制肿瘤增殖生长的作用机制。2.探索GRh2联合mTOR抑制剂提高肿瘤抑瘤效果的作用机制。研究方法:1.体内实验:采用前列腺癌DU145细胞系,通过悬浮球状培养的方法分离富集、培养纯化出肿瘤干细胞微球(Tumor Spheres)。通过流式细胞仪鉴定干细胞表型,并采用动物成瘤实验,将不同数量级的DU145和Tumor Spheres接种到NOD/SCID小鼠双侧腋下,观察成瘤率和成瘤速度,证实Tumor Spheres的肿瘤干细胞特性。采用异种移植实验将Tumor Spheres接种到NOD/SCID小鼠腋下建立荷瘤小鼠模型,用不同剂量的GRh2尾静脉注射干预荷瘤小鼠模型,监测小鼠体重、瘤体体积,4周处死小鼠称量瘤重,明确最佳药物剂量。对瘤体的Notch1,HES1,Sox2,HIF-1α,jagged1等指标进行Western blot,免疫组化,Real-time PCR检测,明确不同药物剂量下对相关蛋白和基因的调控作用。在最佳药物剂量的给药基础上,进一步探索GRh2联合化疗药物环磷酰胺,以及联合mTOR抑制剂雷帕霉素对抑瘤效果的增强作用。2.体外实验:对分离富集、培养纯化的Tumor Spheres进行诱导分化、增殖水平、活性氧簇、细胞周期以及特异性蛋白和基因等检测实验,进一步明确Tumor Spheres的肿瘤干细胞特性。用CCK8法检测GRh2在不同时间点,不同药物浓度对DU145或肿瘤干细胞的增殖影响。用相应的试剂盒检测GRh2对肿瘤干细胞的周期影响、凋亡诱导作用、活性氧簇调控作用以及表面标志物的影响。为了进一步探索GRh2调控肿瘤干细胞生物学行为机制,并对动物实验结果加以验证,收集药物干预的不同浓度、不同时间点的肿瘤干细胞,采用 Western blot 和 Real-time PCR 技术对 Notch1,HES1,Sox2,HIF-1α,jagged1等指标进行检测。采用CCK8法观察GRh2联合mTOR抑制剂或PI3K抑制剂对肿瘤干细胞增殖的影响。并于细胞层面,进一步探索GRh2联合mTOR抑制剂对肿瘤干细胞的抑制作用机制。对动物实验结果进行验证。研究结果1.采用悬浮球状培养的方法在无血清培养基中可以使对数生长期DU145细胞分离富集形成Tumor Spheres,培养3代可达到纯化的目的,流式细胞技术鉴定其高表达前列腺癌干细胞表型 CD44(+)CD24(-/low)(p<0.05)。2.动物成瘤实验,接种Tumor Spheres侧肿瘤成瘤速度和成瘤率均高于接种DU145细胞侧(p<0.05)。3.不同剂量的GRh2干预下的荷瘤小鼠,体重无统计学差异(p>0.05),动物瘤体体积测量和取材剥瘤的瘤重称量提示0.5mg/kg小鼠体重的尾静脉给药剂量,对肿瘤的抑瘤率最高(p<0.05)。4.Western blot和免疫组化结果显示,0.5mg/kg小鼠体重的给药剂量,可下调JAG1,HES1,Sox2,HIF-1 α,NICD,NTM,p-mTOR 蛋白表达水平。5.Real-timePCR结果显示,0.5mg/kg小鼠体重的给药剂量,可显著下调Notch1,HES1,jagged1的mRNA表达水平,对Sox2,HIF-1 α的mRNA表达水平具有上调作用。6.GRh2与化疗药环磷酰胺联用,可提高抑瘤率。7.GRh2与mTOR抑制剂联用,可提高抑瘤率,Western blot结果提示两者联用可提高p-mTOR,NTM,NICD的抑制作用,免疫组化结果提示两者联用可提高HES1,HIF-1α的抑制作用。8.肿瘤干细胞具有更强的自我更新能力和分化潜能,细胞周期检测发现肿瘤干细胞大多数处于细胞周期的GO/G1期。活性氧簇水平检测发现肿瘤干细胞具有更低水平的活性氧簇水平。9.肿瘤干细胞高表达HES1,p-mTOR蛋白,高表达Notch1,HES1,HIF-1α,Sox2,jagged 1 的 mRNA。10.CCK8结果显示,24h、48h、72h的GRh2干预DU145细胞的IC50分别为62.833uM,54.746uM,51.796uM。24h,48h 的 GRh2 干预肿瘤干细胞单细胞的 IC50 分别为71.834uM,70.579uM。24h,48h的GRh2干预肿瘤干细胞球的IC50分别为83.969uM,73.562uM。11.细胞周期结果提示,50uM的GRh2将DU145细胞周期阻滞在S期,75uM的GRh2将DU145细胞周期阻滞在G1期。50uM和75uM可促使肿瘤干细胞由静止状态G1期向S期和G2期发展,100uM将肿瘤干细胞周期阻滞在G2/M期。12.75uM的GRh2可诱导肿瘤干细胞凋亡。13.GRh2可上调DU145细胞和肿瘤干细胞的活性氧簇水平。14.GRh2可下调肿瘤干细胞表面标志物CD44(+)CD24(-/low)的水平,且剂量越高,下调越明显。15.Western blot结果提示,50uM和75uM的GRh2分别干预肿瘤干细胞24h和48h,均可下调蛋白NTM,HES1,Sox2。16.Real-time PCR 结果提示,50uM 和 75uM 的 GRh2 干预 24h,对 Notch1,HES1,HIF-1α,Sox2,JAG1的mRNA均有下调作用。50uM的GRh2干预48h,对Sox2和JAG1的mRNA均有上调作用,而对Notch1,HES1,HIF-1α无显著作用。75uM的GRh2干预48h,对Notch1,HES1,HIF-1α,Sox2,JAG1的mRNA均有上调作用。17.CCK8结果显示,24h和48h组内比较,LY的抑制率均高于RAPA(p<0.01),RAPA+GRh2的抑制率均高于RAPA(p<0.01),LY+GRh2的抑制率均高于LY(p<0.01);24h和48h组间比较,24h的RAPA和LY抑制率均低于48h(p<0.01),而RAPA+GRh2组和LY+GRh2组在24h和48h的抑制率比较无统计学差异(p>0.05)18.Western blot实验对HES1蛋白进行检测,发现GRh2组,联合组,RAPA组对HES1蛋白表达量均有下调作用,均具有统计学差异(p<0.01)。且联合组抑制效果最明显。19.Western blot实验对p-mTOR蛋白进行检测,发现GRh2组,联合组,RAPA组对p-mTOR蛋白表达量均有下调作用,均具有统计学差异(p<0.01)。且联合组抑制效果最明显。结论:1.动物成瘤实验和肿瘤干细胞生物学功能检测均证实Tumor Spheres具有肿瘤干细胞自我更新,分化增殖等生物学特性。2.体内实验中,GRh2尾静脉注射,每周给药2次的用药方式,0.5mg/kg小鼠体重的给药剂量对肿瘤干细胞自我更新能力抑制作用最强。3.体内研究证实GRh2可以通过下调Notch1/HES1信号通路调控肿瘤干细胞的生物学行为,进而抑制肿瘤的增殖生长。4.体内实验证实GRh2联合化疗药物环磷酰胺可以提高抑瘤效果,增加化疗疗效。5.体内实验证实GRh2联合mTOR抑制剂可以通过进一步下调Notch1信号通路和mTOR信号通路,提高抑瘤效果。6.体外实验中,GRh2可以抑制肿瘤干细胞的增殖;GRh2可促使肿瘤干细胞由细胞周期的静止状态G1期向S期和G2期发展;GRh2可诱导肿瘤干细胞凋亡;GRh2可上调细胞内活性氧簇水平;GRh2可抑制具有肿瘤干细胞表面标志物表达的细胞增殖。7.体外实验证实GRh2可以通过下调Notch1/HES1信号通路调控肿瘤干细胞的生物性行为,验证动物实验结论。8.体外实验证实GRh2联合mTOR抑制剂可以通过进一步下调HES1和p-mTOR蛋白,提高对肿瘤干细胞的抑制作用。