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肌生成抑制素(myostatin,MSTN)是一种主要在肌肉组织中表达的分泌蛋白,负调控成肌细胞的增殖和分化。此外,它还控制着卫星细胞(骨骼肌干细胞)的活化和增殖,抑制骨骼肌生长和分化,在哺乳动物生长发育过程中发挥关键作用。MSTN最初在小鼠体内发现,后来发现MSTN序列在不同物种间高度保守。在人,小鼠,牛或绵羊等动物中,人工诱导破坏或MSTN的天然突变都会导致骨骼肌质量的广泛增加,即“双肌肉”表型。横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是在人类和家养哺乳动物中发现的一种异质性肿瘤,因间充质祖细胞/干细胞发生遗传改变而发展。RMS虽然也会表达正常骨骼肌的一些标志物,如N-钙粘蛋白等,但具有过度增殖的能力。然而,尽管在MSTN敲除动物和RMS患者中的MSTN的表达量均降低,MSTN基因敲除的动物的骨骼肌质量虽然明显增加,但是并没有肿瘤细胞样的过度增殖的现象。最近的研究表明微小RNA(miRNAs或miRs)在通过与MSTN的相互作用调节骨骼肌成肌细胞的增殖和分化中也起着关键作用。因此,我们推测骨骼肌发育和生长最重要的负调节因子MSTN的完全缺失会激活一些miRNA,这些miRNA可能会靶向一些调节骨骼肌细胞生长和发育的基因,从而触发负反馈机制以抑制过度的骨骼肌增殖,避免向肿瘤细胞转化。因此,在本研究中,我们通过CRISPR/Cas9技术在MSTN第3外显子上设计sgRNA,通过电击转染获得了小鼠的MSTN-KO的C2C12细胞系,并对该细胞系和阴性对照细胞系分别进行转录组测序和microRNA测序。同时,从GEO数据库中下载了RMS的转录组测序数据。通过对两组数据的比较分析,我们发现MSTN的完全丧失上调了7个miRNA,这些miRNA靶向了由28个下调基因组成的相互作用网络,包括TGFB1,FOS和RB1。而通过对MSTN-KO组和WT组数据的比较,发现有两个microRNA在MSTN-KO组表达水平显著提升,分别是miR-130b-3p和miR-335-5p,同时对应的三个靶基因在MSTN-KO组表达水平显著下降,尤其是FOS和TGFB1。为了研究这两个基因和miRNA之间的潜在作用关系,在WT细胞中过表达了miR-130b-3p和miR-335-5p,然后利用荧光定量PCR测定FOS和TGFB1的表达水平变化。发现过表达miR-130b-3p和miR-335-5p会导致FOS和TGFB1表达量的降低,由此推测,miR-130b-3p和miR-335-5p对FOS和TGFB1可能有直接靶向作用,抑制了原癌及其相关基因的表达。因此,在本实验中我们通过CRISPER/Cas9敲除小鼠成肌细胞的MSTN基因,并通过比较MSTN-KO组和横纹肌肉瘤的转录组数据,找出了潜在的由MSTN敲除而激活的抑制骨骼肌细胞过度生长的miRNA,并通过实验对miRNA-mRNA的靶向关系进行了验证。我们期望这些数据可以为进一步探讨MSTN在RMS的分子机制中的作用提供理论基础。