基于GWAS与RNA-Seq技术挖掘甘蓝型油菜氮高效相关QTLs与候选基因

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油菜是世界四大油料作物之一,其中甘蓝型油菜(Brassica napus L.)因其产量高、适应性强等特点,种植面积最大,是我国主要的油料作物。其生长发育过程中氮需求量较高,但其氮肥的利用率却普遍较低,在很大程度上限制了油菜生长。筛选甘蓝型油菜氮高效种质资源,挖掘低氮胁迫相关抗性QTLs和基因,可以减少农田氮肥施用量,降低生产成本,保护生态环境,同时也可为甘蓝型油菜氮高效新品种的选育提供优异种质资源。目前,关于甘蓝型油菜低氮胁迫抗性相关的QTLs和功能基因的研究还比较少见。本研究建立了一套效率高、通量大的甘蓝型油菜水培表型鉴定体系,以232份甘蓝型油菜核心种质为材料,对正常氮和低氮水平下不同基因型油菜表型数据进行了精确鉴定。进一步利用GWAS技术,对低氮胁迫下甘蓝型油菜氮利用效率性状相关的SNP位点进行了全基因组范围内的扫描;联合RNA-Seq结果筛选定位到了与低氮胁迫下油菜氮高效性状相关的候选基因,探究甘蓝型油菜响应缺氮胁迫及氮高效的遗传机制,为选育耐低氮胁迫油菜新种质提供了理论支撑。主要研究结果如下:(1)对油菜水培体系进行了改良,主要包括对营养液配方的进一步改良和水培过程中营养液的循环控制等环节。成功改良了油菜正常氮和低氮营养液配方,完善了油菜水培技术。已建成一套半自动化的油菜水培平台,主要包括培养池、营养液循环系统和空气泵等。该设备可同时种植超过6000株油菜幼苗,精确可控的油菜水培平台为准确鉴定油菜耐低氮胁迫表型提供了技术支持。(2)比较分析232份甘蓝型油菜核心种质在两种氮素水平下营养生长期的表观性状,研究低氮胁迫对甘蓝型油菜生长规律的影响。表型性状鉴定及其遗传变异结果显示,供试的232份油菜种质具有广泛的遗传多样性。在正常氮(N:6 mmol/L)和低氮胁迫(N:0.3 mmol/L)条件下,鉴定了油菜包括地上部鲜重(SW)、地下部鲜重(RW)、地上部干重(DSW)、地下部干重(DRW)、叶片数(LN)、株高(SL)、总根长(RL)、根平均直径(RAD)、侧根数(RT)、地上部氮浓度(SNC)、地下部氮浓度(RNC)、植株总氮量(N)和氮利用效率(NUE)12种表型性状指标,其中DSW、DRW和N在两种氮营养条件下变异系数均较大,表现出丰富的种质间差异;LN、SL和RAD在两种氮营养条件下变异系数都较小,种质间差异较小。与对照条件比起来,低氮胁迫条件下观察到SW、RW、DSW、DRW、LN、SL、RAD、SNC、RNC、N和NUE显著降低,而RL和RT显著增高,低氮胁迫明显抑制了油菜的生长,油菜通过伸长根长、增加侧根数的方式应对低氮胁迫。根据表型数据分布情况,无论是正常氮还是低氮条件下,所有表型都呈现出连续性正态分布,确定几种性状均为受多基因控制的数量性状。根据其苗期生物量和氮效率,筛选出氮高效和氮低效的油菜种质资源各4份。(3)利用表型数据,结合重测序结果,进行GWAS分析。共检测到与油菜低氮胁迫下性状相关的SNP位点70个,其中Bn-A06-p24386467位点同时关联到三个性状,还有9个SNP位点同时关联到两个性状。位点分布于甘蓝型油菜除A01和A05外的所有染色体上,其中,C01染色体上分布位点最多,达19个。并根据已公布的甘蓝型油菜基因组注释信息,重点关注调控油菜氮代谢、光合作用、糖代谢和氨基酸合成相关的基因,在各染色体LD衰减距离上下游进行筛选,共筛选出101个候选基因,其中与氮代谢相关的有18个、与光合作用相关的有26个、与糖代谢相关的有34个、与氨基酸合成相关的有16个、与脂代谢相关的有7个。(4)结合氮高效材料D4-15和氮低效材料D2-1的转录组学数据得到的基因表达水平差异结果,与GWAS筛选出的氮高效候选基因进行比对,结果共筛选出14个与油菜氮高效相关的关键候选基因Bna A02g34030、Bna A08g14220、Bna A08g14870、Bna A08g16370、Bna A08g23760、Bna A09g00320、Bna A10g23060、Bna A10g23990、Bna A10g26450、Bna C02g42890、Bna C03g21300、Bna C04g07100、Bna C04g51220和Bna C07g22450。
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