猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PRo V）、猪札幌病毒（Porcine Sapovirus,Po Sa V）和猪星状病毒（Porcine astrovirus,PAst V）既是危害养猪业的常见肠道病原,又与人类婴幼儿腹泻相关,临床症状及病理变化均相似,难以区分,需依靠实验室检测技术加以鉴别诊断。因此,建立快速准确PRo V、Po Sa V和PAst V鉴别检测方法,不仅对猪群腹泻的监测和防控具有重要意义,也可以为兽医公共卫生提供技术支持。同时,小肠是大多数肠道病毒的主要侵害部位,猪小肠上皮细胞的分离及永生化将有助于肠道病毒研究的开展。1、猪轮状病毒、札幌病毒和星状病毒三重PCR检测方法的建立参考PRo V的VP6基因、Po Sa V的Rd Rp基因以及PAst V的ORF1基因的保守序列分别设计特异性引物,对PCR各反应条件进行摸索和优化,建立了能同时鉴别诊断PRo V、Po Sa V和PAst V的三重PCR。该方法特异性好,对TGEV、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等常见猪病的检测结果均为阴性;敏感性高,对PRo V、Po Sa V和PAst V的检测限量低,分别为1.38×10~2、8.33×10~2和4.4×10~3copies/μL;与单一PCR检测结果基本一致,方法准确可靠。利用该方法对253份规模化猪场的临床腹泻样品进行检测,发现PRo V、Po Sa V和PAst V阳性率分别为9.09%、2.37%和5.14%,并且存在混合感染现象,其中有2份样品为PRo V与Po Sa V的混合感染。另外,还发现PRo V常与猪流行性腹泻病毒混合感染,Po Sa V与常见的病原均可发生混合感染。2、巴马小型猪小肠上皮细胞的初步分离选用出生12h内未吃初乳的巴马小型猪,在猪安乐死后,解剖取出仔猪小肠,通过组织块培养法对小肠进行处理,并结合细胞刮除、胰酶消化以及96孔筛选三种方法对小肠细胞进行分离纯化,获得鹅卵石样排列紧密的细胞,经细胞角蛋白18鉴定证明分离获得的细胞为猪小肠上皮细胞。同时,通过设计引物,在序列两端分别加入两个酶切位点Xba I和Sal I,将已鉴定的SV40LT和h TERT基因片段分别连至plenti CMV GFP Hygro载体,构建plenti-SV40LT和plenti-h TERT永生化质粒,鉴定后,将其分别转染293T细胞,成功获得重组慢病毒,为下一步筛选巴马小型猪小肠上皮细胞系提供了材料。本研究成功建立了PRo V、Po Sa V和PAst V三重PCR检测方法,对这三种人兽共患病的监测和防控提供指导,具有公共卫生意义;同时还成功分离获得广西地方猪种巴马小型猪小肠上皮细胞,并构建永生化质粒plenti-SV40LT和plenti-h TERT,包装重组慢病毒,为构建广西地方猪种猪小肠上皮细胞系奠定基础。