目的:以往大量的实验证明,预先给予轻微的、短时的、不至于对锥体神经元造成损伤的脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP),可以减少缺血-再灌注损伤,产生脑缺血耐受(brain ischemictolerance,BIT)。脑缺血预处理对机体的保护作用实际上是通过启动机体内源性保护机制实现的。此理论自从1990年被日本著名科学家Kitagawa提出后,全世界许多科学家进行了大量的动物实验,证明了此观点的正确性。核转录因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)是一种细胞核转录因子,NF-κB信号通路属于受调蛋白水解酶依赖的受体信号传导通路,其与肿瘤的发生、生长、分化、凋亡、感染以及转移密切相关;此外,NF-κB在静息状态下与IκB在细胞的胞浆中形成复合体,当某些因素刺激细胞时,可使IκB发生磷酸化并与NF-κB发生解离,从而使NF-κB激活,被激活的NF-κB参与到基因转录过程中。NF-κB有许多亚型,而P50和P65就是其中最重要的两个,它们在协调免疫功能以及抗感染方面有着重要的作用。但在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中不同时间段如何变化目前尚不清楚。过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome prolifer atoractivatedreceptors,PPAR)是一类可被配体激活的核转录因子超家族成员,其对细胞的生长、分化、凋亡等具有重要调节作用。PPAR包括3种亚型,即PPARα、PPARβ、PPARγ。其中PPARγ被激活后可以产生多种生物学效应,可以很好的保护脑组织对抗机体的缺血性打击,而且在许多临床疾病中如:肝硬化、动脉粥样硬化、高血压以及高血脂等具有很好的缓解效果。基于以上分析,本实验旨在观察脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中在海马CA1区NF-κB P50和P65以及PPARγ蛋白表达的变化,从而为临床上脑缺血疾病的预防和治疗提供相应的理论依据。方法:采用四血管闭塞全脑缺血模型,选用健康雄性Wistar大鼠(280-300g)102只,随机分为以下六组:(1)control组(n=3):不进行任何处理。(2)sham组(n=3):暴露双侧椎动脉,暴露双侧颈总动脉,但均不阻断其血流。(3)凝闭椎动脉(vertebral artery occlusion,VAO)组(n=24):永久性凝闭双侧椎动脉,48 h后暴露双侧颈总动脉,不阻断血流。(4)CIP组(n=24):永久性凝闭椎动脉,48 h后夹闭双侧颈总动脉3min后恢复血流再灌注。(5)损伤性缺血(ischemic insult,II)组(n=24):永久性凝闭椎动脉,48 h后夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复血流再灌注。(6)CIP+II组(n=24):永久性凝闭椎动脉,48 h后先夹闭双侧颈总动脉3 min,然后恢复血流再灌注48 h后,再夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复血流再灌注。除control组和sham组之外,其余4组都选取8个时间点,分别是假手术处理后或末次缺血后的0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、2 d、7 d(每个时间点n=3)。在规定的时间点,断头取大鼠的脑组织,通过应用硫堇染色观察大鼠海马CA1区锥体神经元的存活情况;通过免疫组织化学技术(immunohistochemistry)观察NF-κB P50、P65、PPARγ蛋白在大鼠海马CA1区的表达程度以及变化趋势。结果:1神经病理学评价通过对大鼠脑片进行硫堇染色可以观察到,control组大鼠海马CA1区神经元排列致密有序、整齐、2-3层,细胞形态完整,胞核清晰可见,核仁饱满。与control组对比,Sham组大鼠海马CA1区神经元形态无显著变化,ND无显著差异(P>0.05)。VAO组与sham组对比,各个时间点细胞形态无显著变化,ND无显著差异(P>0.05)。CIP组各时间点CA1区的神经元均未见显著损伤,与VAO组各相应时间点相比,细胞形态无显著变化,ND无显著差异(P>0.05)。II组6 h之内CA1区的神经元未见显著损伤;2 d时可见部分细胞萎缩、变性、坏死,核仁萎缩,细胞排列开始变得不规则;7d时可见大量细胞变性坏死,正常的神经元几乎不可见。与VAO组相比,2 d和7 d时间点细胞形态有显著变化,ND显著降低(P<0.05)。CIP+II组即刻时间点、6 h时间点、2 d时间点CA1区神经元均无显著受损;在7 d时间点有个别细胞丢失坏死,细胞排列较为规则。与II组对比,7 d时间点细胞数量显著增多,核仁清晰,细胞排列规则,具有显著差异(P<0.05)2在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中,大鼠海马CA1区NF-κBP50蛋白表达的对比以及变化趋势Control组、sham组以及VAO组,可见NF-κB P50蛋白在胞核内几乎不表达,但胞浆内有一定数量的表达。Sham组与control组相对比,蛋白表达量无显著差异(P>0.05);VAO组与Sham组相对比,各个时间点蛋白表达量亦无显著变化(P>0.05)。CIP组即刻时间点NF-κB P50蛋白在胞核内几乎不表达,但在胞浆内有一定表达量。从30 min起,NF-κB P50蛋白逐渐在胞核内开始有所表达,积分光密度也显著增加(P<0.05);从1 h开始,胞核内NF-κB P50的表达更加显著,到了6 h时,蛋白表达在胞核内达到顶峰(P<0.05)。2d时,胞核内NF-κB P50蛋白表达量显著减少,积分光密度也显著下降,几乎达到了VAO组相应时间点的水平(P>0.05)。此水平一直持续至7 d时间点。II组即刻时间点NF-κB P50在胞核内几乎不表达,但在胞浆内有一定表达量。从30 min开始,胞核内蛋白表达量有了显著升高,与VAO组相比,30 min、1 h、3 h、6 h时间点胞核内的蛋白表达量有了显著升高,积分光密度也随之升高,并在6 h时间点达到顶峰(P<0.05),此时胞浆内与胞核内均可见大量蛋白表达。2 d时间点NF-κB P50蛋白含量显著下降,降低至VAO组相应时间点水平(P>0.05)。7 d时间点由于神经元大量死亡,NF-κB P50蛋白含量显著下降,与VAO组相对比有显著降低(P<0.05)。CIP+II组即刻时间点NF-κB P50在胞核内几乎不表达,但在胞浆内有一定的表达量。从30 min开始,胞核内开始逐渐出现蛋白表达,积分光密度也开始有所上升,但与即刻时间点相比差异仍不明显(P>0.05);与即刻时间点相比,1 h、3 h、6 h时间点胞核内蛋白含量有了显著上升(P<0.05)。2 d时间点胞核内表达量显著降低,积分光密度也开始降低,几乎达到了VAO组相应时间点的水平。对比各组6 h时间点NF-κB P50蛋白的表达数量,与VAO组对比,CIP组、II组此时间点NF-κB P50蛋白含量均显著升高(P<0.05);与CIP组相比,II组NF-κB P50蛋白含量进一步增高(P<0.05);与II组相比,CIP+II组蛋白含量显著下降(P<0.05)。对比各组7 d时间点NF-κB P50的表达数量,与VAO组相对比,CIP组NF-κB P50蛋白含量无显著差异(P>0.05),II组显著下降(P<0.05);与II组相比,CIP+II组NF-κB P50蛋白含量显著上升(P<0.05)。3在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中,大鼠海马CA1区NF-κBP65蛋白表达的对比以及变化趋势Control组、sham组以及OVA组NF-κB P65蛋白在胞核和胞浆中均有一定程度的表达。CIP组NF-κB P65蛋白表达在30 min时间点之前未见显著变化(P>0.05);从1 h时间点起积分光密度显著增加,3 h、6 h时间点进一步增高,胞核和胞浆内均有大量蛋白表达,并于6 h时间点达到顶峰(P<0.05);此后的变化趋势与NF-κB P50的一致。II组NF-κB P65蛋白表达在15 min时间点之前未见显著变化;从30min时间点起积分光密度显著增加,1 h、3 h、6 h时间点进一步增高,胞核和胞浆内均有大量蛋白表达,并于6 h时间点达到顶峰;2 d时间点,NF-κB P65蛋白表达显著减少,尤其以胞核中减少为主,但表达量仍高于VAO组相应时间点(P<0.05);此后的变化趋势与NF-κB P50的一致。CIP+II组NF-κB P65蛋白表达在15 min时间点之前未见显著变化;从30 min时间点起积分光密度显著增加,1 h、3 h、6 h时间点进一步增高,胞核和胞浆内均有大量蛋白表达,并于6 h时间点达到顶峰。此后的变化趋势与NF-κB P50的一致。对比各组6 h时间点NF-κB P65蛋白的表达数量,与VAO组对比,CIP 6 h、II 6 h时间点蛋白含量有显著上升(P<0.05)。与II 6 h时间点相比,CIP+II 6 h时间点蛋白含量有显著下降(P<0.05)。对比各组7 d时间点NF-κB P65蛋白的表达数量,与VAO组对比,CIP 7 d时间点蛋白含量无明显差异(P>0.05),II 7 d时间点显著下降(P<0.05)。与II 6 h时间点相比,CIP+II 6 h时间点蛋白含量有显著上升(P<0.05)。4在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中,大鼠海马CA1区PPARγ蛋白表达的对比以及变化趋势Control组、sham组以及VAO组可见PPARγ蛋白在胞核和胞浆内均有一定程度的表达。CIP组PPARγ蛋白表达在15 min时间点之前未见显著变化(P>0.05);从30 min时间点起积分光密度显著增加,1 h、3 h时间点进一步增高,胞核和胞浆内均有大量蛋白表达,并于3 h时间点达到顶峰(P<0.05)。在6h、2 d、7 d时间点时,胞核内PPARγ蛋白表达量显著下降,几乎达到了VAO组相应时间点的水平。II组PPARγ蛋白表达在15 min时间点之前未见显著变化(P>0.05);从30min时间点起积分光密度显著增加,1 h、3 h、6 h时间点进一步增高,胞核和胞浆内均有大量蛋白表达,并于6 h时间点达到顶峰(P<0.05)。2d、7 d时间点由于神经元大量死亡,所以PPARγ蛋白含量显著下降,与VAO组相对比有显著下降(P<0.05)。CIP+II组PPARγ蛋白表达在1 h时间点之前未见显著变化(P>0.05);从3 h时间点起PPARγ蛋白表达显著增加,6 h时间点进一步增高,胞核和胞浆内均有大量蛋白表达,并达到峰值(P<0.05)。此后的变化趋势与P50的一致。对比各组6 h时间点PPARγ蛋白的表达数量,与VAO组对比,CIP组此时间点PPARγ蛋白含量无显著差异(P>0.05),II组此时间点PPARγ蛋白含量有显著增高(P<0.05);与CIP组相比,II组PPARγ蛋白含量显著增高(P<0.05);与II组相比,CIP+II组蛋白含量显著下降(P<0.05)。对比各组7 d时间点PPARγ蛋白的表达数量,与VAO组相对比,CIP组PPARγ蛋白含量无显著差异(P>0.05),II组显著下降(P<0.05);与II组相比,CIP+II组PPARγ蛋白含量显著上升(P<0.05)。结论:1脑缺血预处理适度上调NF-κB P50、NF-κB P65以及PPARγ蛋白的表达,而且以胞核内表达增高为主。2严重的缺血打击,过度上调NF-κB P50、NF-κB P65以及PPARγ蛋白的表达,也以胞核内表达增高为主。3缺血预处理可以有效阻止其后的严重的缺血打击所导致的NF-κBP50、NF-κB P65以及PPARγ蛋白的过度上调。