WNT2基因在苏博美利奴羊皮肤组织中的DNA甲基化调控及其功能分析

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:javajava2010
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毛发是毛囊生长发育的产物,而毛囊是皮肤的衍生物,其结构和特性对毛发的品质及产量有重要影响。毛囊的生长发育是一个复杂且长期的生理过程,受多种物理因素和信号通路调控,而基因表达是影响动物毛发生长发育的决定性因素之一。因此,增加对毛囊发育相关基因功能的了解,有助于深入解析毛囊发育的分子调控机制。首先,本研究应用qRT-PCR技术检测了WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135d(毛囊成熟时期)不同组织中的表达特异性;利用BSP、qRT-PCR以及WesternBlot技术检测了周岁苏博美利奴羊皮肤组织中WNT2基因第5外显子的DNA甲基化水平、mRNA以及蛋白质表达量,并分析了该基因DNA甲基化水平与表达量之间的关系;构建了慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体,初步验证了该基因功能;将慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体共转染至绵羊皮肤成纤维细胞中,最后使用CCK-8试剂盒鉴定了绵羊皮肤成纤维细胞的增殖情况,进一步确定WNT2基因对毛囊发生发育的影响。主要结果如下:
  1、WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135d的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及皮肤组织中均有表达,且在皮肤组织中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01);
  2、WNT2基因的第5外显子甲基化水平在极细组和极粗组中均较高,且两组DNA甲基化水平与表达水平变化趋势一致,即WNT2基因的mRNA、蛋白表达水平与DNA甲基化水平在极细组均高于极粗组,CpG11位点的甲基化水平与mRNA表达量之间呈现显著正相关(P<0.05,r=0.693);
  3、经双酶切与测序鉴定,成功构建了慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体;
  4、通过CCK-8法对转染慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体后的绵羊皮肤成纤维细胞的增殖情况进行检测,发现WNT2基因对绵羊皮肤成纤维细胞的增殖有促进作用。
  综上所述,本研究结果明确了WNT2基因是影响皮肤及毛囊发育的关键基因,在苏博美利奴羊群体中证实了WNT2基因第5外显子的DNA甲基化促进基因表达,进而对羊毛纤维直径起到正向调控作用,并从细胞水平进一步验证了WNT2基因对绵羊皮肤和毛囊发育的作用,本研究结果将为后续研究绵羊皮肤及毛囊发育和基因调控机制的研究提供理论依据。
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  试验结果表明:
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