论文部分内容阅读
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。多种癌基因和抑癌基因的异常与胃癌的发生发展密切相关，但是目前关于对胃癌防治具有重要意义的靶基因报道很少。因此，研究与胃癌密切相关的基因十分必要。为此本课题组前期应用抑制消减杂交(SSH)筛查发现一些在胃癌中差异表达的基因，进一步应用基因芯片、斑点杂交等技术检测相关基因在异型增生、早期胃癌、进展期胃癌组织、淋巴结转移癌以及癌旁组织中的表达，进一步证实了这些基因在胃癌发生发展不同阶段的差异表达情况。核糖体蛋白S12(Ribosomal protein S12，RPS12)基因是其中之一。该基因在胃癌发生发展不同阶段病变的标本中表达增高，是胃癌发生、发展不同阶段的重要差异表达基因。但是该基因在胃癌发生发展中的作用究竟如何，有待通过进一步实验证实。在前期工作的基础上，为深入研究RPS12基因在胃癌中的作用，本课题拟构建RPS12基因shRNA表达载体，转染胃癌细胞并证实对RPS12基因的抑制作用后，观察对胃癌细胞生物学特性如细胞凋亡、增殖的影响，并探讨其分子机制。本研究将加深对胃癌分子机制的理解，并有望发现胃癌诊治、预后判定的新标志。材料及方法1．实验材料：胃癌细胞系BGC823、RPMI1640培养基、TRIZOL Reagent、Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒、质粒提取试剂盒(Qiagen)；脂质体转染试剂盒(invitrogen)，BamHⅠ、BindⅢ、EcoRⅠ核酸内切酶(Takara)；PI、JM109感受态细胞(联星公司)等。2．实验方法：应用重组DNA技术构建RPS12特异性sbRNA表达载体，基因转染技术将RPS12特异性shRNA表达载体转染胃癌细胞，以scramble-shRNA为对照，RT-PCR方法检测BGC823细胞中RPS12基因的表达，证实干涉效应。MTT、流式细胞术(flow cytometry，FCM)分析RNA干涉后细胞增殖和凋亡，以探讨RPS12基因对胃癌细胞生物学特性的影响。同时采用RT-PCR检测RNA干涉后胃癌细胞中凋亡相关基因mRNA表达水平，探讨RPS12基因对细胞凋亡影响的分子机制。结果1．RPS12 RNAi抑制胃癌细胞中RPS12 mRNA表达：RT-PCR扩增结果显示，与对照组相比，RPS12-shRNA表达载体转染RPS12基因第3、5、7天后，RPS12 mRNA表达均下调，其中第5天下调最明显。2．RPS12 RNAi使胃癌细胞增殖能力降低：MTT检测发现RNA干涉RPS12基因第3、5、7、9天后，细胞增殖能力与对照组相比均降低，其中第5天降低最明显。3．RPS12 RNAi使胃癌细胞凋亡率增加：RNA干涉RPS12基因使胃癌细胞凋亡增加，干涉后第7天凋亡率为17.84％，是对照组的9倍。4．RNAi抑制RPS12基因表达对胃癌细胞Bcl-2 mRNA表达的影响：RNA干涉第5天、7天后实验组与对照组相比Bcl-2mRNA表达明显下调，Bax mRNA的表达无明显改变。提示RPS12基因可能通过调节Bcl-2基因表达参与调节胃癌细胞凋亡。结论应用RNAi方法证明RPS12基因有抑制胃癌细胞凋亡，促进胃癌细胞增殖的作用，同时初步证明RPS12基因与Bcl-2基因有关，RPS12可能作为上游基因调控Bcl-2基因表达而影响细胞凋亡。