倍半萜内酯是菊科植物的特征化合物和主要药效成分,具有显著的生物学和药理学活性,如抗癌和抗痢疾作用等。起源于GermacreneAacid(GAA)碳骨架的倍半萜内酯化合物根据其内酯环空间位置和立体异构的不同分为C12,6α型、C12,6β型、C12,8α型、C12,8β型四种类型,并由不同CYPs酶催化GAA碳骨架形成。当前四种类型倍半萜内酯化合物中只有C12,6α型倍半萜内酯环的形成机制被成功解析,其他类型倍半萜内酯环的形成机制目前仍然不清楚。本论文借助转录组学、生物化学及植物化学等手段,主要围绕C12,8型倍半萜内酯环成环的分子机制和桉烷型倍半萜内酯核心碳骨架形成的分子机制展开。本论文首先开展C12,8型倍半萜内酯环成环分子机制的解析工作,我们从湖北恩施特种旋覆花(Inula huphensis)植物中成功分离到一条P450酶Ih8H,Ih8H催化底物GAA同时生成两种立体异构产物8α-OH GAA和8β-OH GAA,8α-OH GAA能进一步自动环化形成C12,8α型倍半萜内酯化合物Inunolide,而8β-OHGAA相当稳定不能自动环化成相应内酯产物。Ih8H与已报道的C6-α羟基化和C8-β羟基化功能酶CYP71BL1/2同源性分别为63%和66%,表明Ih8H与其他立体异构CYPs进化路线相同,但Ih8H表现出立体异构非选择的特征。通过分析不同组织中Ih8H基因的表达和C12,8型倍半萜内酯化合物积累关系,以及在外源MeJA诱导条件下Ih8H基因的表达和C12,8型倍半萜内酯化合物变化关系,进一步明确了 Ih8H酶在C12,8型倍半萜内酯的生物合成途径中起到关键性作用。为进一步确定Ih8H的功能,本研究还从另外2种菊科植物(苍耳Xanthium strumarium和线叶旋覆花Inula lineariifolia)中分离了Ih8H的同源基因,并开展了其生化功能分析,得出如下结果:1、从来源于中国湖北省以及河南省的苍耳植物分离了 Ih8H同源基因,分别命名为Xs8H-HB与Xs8H-HN,生物化学研究表明Xs8H-HN能催化底物GAA形成C12,8α型倍半萜内酯化合物Inunolide和中间产物8β-OH GAA,而Xs8H-HB无催化GAA活性,进一步通过定点突变技术证实苍耳Xs8Hs中第116位氨基酸是控制催化GAA的关键活性位点;2、从线叶旋覆花中分离了 Ih8H同源基因,将其命名为Il8H,生化功能分析显示Il8H催化了Ih8H—样的酶活性。综上所述,本部分研究成功解析了 C12,8α型倍半萜内酯环成环的分子机制,从菊科植物中成功分离鉴定的3个Ih8H同系物(Ih8H、Il8H和Xs8H-HN)为以后代谢工程学合成12,8a型倍半萜内酯提供基因元件,同时,在Xs8Hs中控制其催化活性的第116位氨基酸的成功解析为自然界中CYP酶催化不同空间位置和立体异构选择机制的解析提供参考。紧接着论文的第二部分内容解析了桉烷型倍半萜内酯核心碳骨架形成的分子机制。从湖北恩施特种旋覆花植物中挖掘到1条新的倍半萜碳骨架形成酶—10-epi-Junenol合酶(IhsTPS1),IhsTPS1催化桉烷型倍半萜碳骨架产物10-epi-Junenol的形成,10-epi-Junenol合酶是从植物界中分离鉴定的新的倍半萜合酶,10-epi-junenol生物合成机制的成功解析将为下游Junenol骨架的桉烷型倍半萜内酯生物合成途径的解析提供前期基础;此外,IhsTPS1的催化产物10-epi-junenol是挥发性精油的重要成分,它们的成功挖掘为将来利用合成生物学策略开发为香料和化妆品提供基因元件。