富集禽流感病毒生物磁珠的研究与应用

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禽流感是由A型流感病毒引起的,在野生鸟类及家禽中流行的一种传染性疾病。高致病性禽流感病毒的爆发,可以引起养禽业巨大的经济损失,并严重威胁着人类的健康。保证禽流感病毒的阳性检出率、及时监控禽流感并提高控制禽流感的手段对于养禽业的发展及预防人流感的流行是至关重要的。在检测样品体积大、病毒浓度较低的情况下首先要对样品中的病毒进行富集。常用的方法主要有PEG沉淀法和超速离心法。这两种方法步骤简单并且易于执行,但是PEG沉淀法会抑制PCR的反应并且他们都会减弱流感病毒的毒力,繁琐的操作过程也会造成样品毒力的减弱以及样品间的交叉污染。本研究建立了一种生物磁珠富集方法,可以富集液体中的禽流感病毒,操作简单,可减少检测所需时间提高检测效率,降低假阴性率,并且保证病毒仍具有生物活性,为进一步研究该病毒的特征奠定了基础。1.生物磁珠的构建胎球蛋白(Fetuin)中含有丰富的α-2,3-和α-2,6-唾液酸,这两种唾液酸正是人流感及禽流感病毒的受体。根据病毒与受体相作用的原理,将胎球蛋白分别与氨基化和羧基化的磁球进行偶联,制备成生物磁珠。结果显示,以5%戊二醛为活化剂活化氨基磁珠1h较以2.5%、7.5%的戊二醛为活化剂每毫克结合胎球蛋白量更多,为8.12μg;以pH4.5MES(2‐(N‐吗啉)乙磺酸)为活化缓冲液活化羧基磁珠,9h每毫克可以结合9.8μg的胎球蛋白,pH4.5PBS(磷酸盐缓冲液)为活化缓冲液每毫克可以结合9.25μg的胎球蛋白。将两种生物磁珠与含H5N1亚型禽流感病毒的尿囊液进行作用,结果显示两种生物磁珠对H5N1亚型禽流感病毒具有富集作用。2.生物磁珠性能及应用的初步研究对生物磁珠富集H5N1亚型禽流感病毒的敏感性,特异性,吸附与释放特性,生物活性的性能进行了研究。以及将生物磁珠应用于H1N1亚型禽流感病毒的富集,淤泥以及空气样本中H5N1亚型禽流感病毒的富集作用进行了研究。结果表明氨基化生物磁珠富集检测到108倍的H5N1病毒稀释液,羧基化生物磁珠可富集检测到1015倍的H5N1病毒稀释液;所制备的生物磁珠对新城疫Ⅰ系病毒没有富集作用,而对H1N1亚型禽流感病毒同样具有富集作用;富集禽流感病毒的生物磁珠可将富集的病毒在37℃释放下来,并且释放的病毒依然具有血凝活性且可在鸡胚中增殖;生物磁珠同样可以富集淤泥和空气中的禽流感病毒。
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