研究背景：寒冷作为一种有害的环境因素，可导致机体多种疾病的发生，其中以冻疮、冻伤等冷诱导机体肢端损伤的发生最为常见。以往关于冷诱导机体肢端损伤的研究表明，皮下微循环障碍是寒冷损伤发生发展的始动因素，而寒冷诱导的皮下微血管内皮细胞功能紊乱则在这一过程中起到关键作用。因此，许多学者提出，血管内皮细胞是机体冷暴露过程中最先做出反应并受到损伤的部位。另外，不同程度低温持续暴露常可使机体肢端皮肤出现不同的改变。正常情况下，人体的皮温为32℃；当皮肤温度降至29℃时，机体即可感到不适；降至28℃以下时，躯体即感觉到凉爽；降至17℃以下时，机体出现疼痛感，此时可能发生冻疮；当温度降至12℃以下时，麻木感出现，常可见浸渍足或战壕足的发生；而在8℃以下则彻底失去痛觉感受，至0℃即刻，皮下微血管系统即可出现明显的形态学改变与亚细胞结构改变；至-2℃以下，皮肤及皮下血管即可发生冻结，发生冻伤。这些结果提示，在机体冷损伤发生发展的过程，皮下微血管内皮细胞经历了不同程度低温的刺激并发生了相应的病变，进而导致不同程度冷损伤的发生。真皮微血管内皮细胞（dermal micorvascular endothelial cells，DMVECs）作为皮肤组织最外层部位的一类血管内皮细胞，在机体进出不同温度环境的过程中，必然经历了不同温度的刺激，并产生相应功能的改变。目前，关于DMVECs如何感知低温刺激以及低温直接导致其损伤的分子机制仍不明确，但是，瞬时感受器电位离子通道家族（transient Receptor Potential，TRP）的发现及其功能的揭示可能为我们提供了一条可寻的途径。TRPs是一类可被多种因素刺激激活后允许阳离子通过的膜离子通道，很多研究表明，其在血管内皮细胞功能的调节中起到关键作用。另外，该家族中包括TRPV1、V2、V4，TRPM8及TRPA1在内的成员被证实是机体感知不同环境温度的关键，其中TRPM8可在28℃至8℃范围内开放，这恰与前述寒冷损伤过程中真皮微血管内皮细胞所经历的温度范围趋于一致。因此，本研究拟通过建立体外大鼠DMVECs低温暴露模型，探讨不同程度低温对DMVECs的影响是否存在差异，也就是说，DMVECs是否能够感知不同程度低温的刺激并做出不同反应，另外，我们拟通过对DMVECs中TRPM8的表达进行鉴定，初步探讨低温影响大鼠DMVECs的分子机制，从而为进一步探索冷诱导机体肢端损伤的机制，预防和诊断冷损伤疾病的发生以及开展促机体冷习服药物的研发提供理论依据。研究目的：通过建立体外大鼠DMVECs低温暴露模型，阐明不同低温刺激对大鼠DMVECs的影响，明确大鼠DMVECs对不同低温刺激的反应，并通过对大鼠DMVECs TRPM8的表达及功能进行分析，初步探讨低温影响大鼠DMVECs功能改变的分子机制。研究方法：1.大鼠DMVECs的培养与鉴定：采用非连续密度梯度Percoll分离法制备大鼠DMVECs；通过细胞形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定、CD31免疫荧光鉴定以及植物凝集素结合实验对所培养的细胞进行鉴定。2.大鼠DMVECs低温暴露模型的建立：将DMVECs分别于不同程度低温（28℃、12℃及0℃）条件下暴露24h，以37℃为对照组，通过细胞形态学观察、MTT法检测细胞活力及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒测定细胞培养上清中LDH活性，对低温暴露模型进行评价，并初步探讨大鼠DMVECs接受不同低温刺激后的反应。3.不同低温暴露对大鼠DMVECs细胞相关细胞因子基因表达的影响：采用RT-PCR法对不同低温刺激后大鼠DMVECs中包括血管通透因子VEGF及AQP-1，血管收缩因子ET-1，细胞粘附分子ICAM-1，细胞炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α等在内的细胞因子mRNA表达情况进行半定量分析，探讨大鼠DMVECs对不同程度低温刺激反应后相关基因的表达差异。4.大鼠DMVECs中TRPM8的鉴定：通过设计大鼠TRPM8mRNA的上下游引物，采用RT-PCR法对其mRNA表达进行初步鉴定，并对PCR产物进行测序分析；采用免疫荧光双染法对大鼠DMVECs中TRPM8蛋白的表达进行鉴定。5. TRPM8参与低温对DMVECs功能影响的机制：采用不同浓度AMTB（25μmol/L及75μmol/L）阻断大鼠DMVECs TRPM8通道后，将DMVECs于12℃暴露12h，而后利用RT-PCR法对DMVECs的VEGF、ET-1及IL-6等细胞因子及TRPM8的基因表达情况进行半定量分析，初步明确大鼠DMVECs TRPM8的通道活性，探讨其参与低温对大鼠DMVECs功能影响的可能机制。研究结果：1.大鼠DMVECs的培养与鉴定：分离于21-35%梯度间的细胞于培养后第五天融合成单层细胞，且呈典型的铺路石样结构，Ⅷ因子相关抗原及CD31表达均呈阳性，植物凝集素（BSI）结合实验也呈阳性结果，证明所培养的细胞为大鼠真皮微血管内皮。2.大鼠DMVECs低温暴露模型的建立：大鼠DMVECs于不同低温条件（28℃、12℃及0℃）暴露24h后，与37℃组比较，28℃组细胞形态无明显改变，12℃组趋于“成纤维样”变化，但细胞形态保持完整，仅部分细胞间出现缝隙，0℃组细胞则出现明显皱缩；MTT结果显示，28℃组、12℃组及0℃组细胞增殖率较37℃组分别下降了4%、10%以及20%（P＜0.05），且各低温组之间差异具有统计学意义（P＜0.01），提示大鼠DMVECs细胞增殖率可随温度降低而降低；28℃、12℃及0℃组细胞培养液中LDH活性（U/L）分别为54.17±3.02，64.66±3.03，82.13±10.91，与37℃组（12.23±3.03）比较差异具有统计学意义（P0.01），说明随温度降低，大鼠DMVECs细胞损伤程度加重。以上结果表明大鼠DMVECs低温暴露模型构建成功。3.不同低温对大鼠DMVECs相关细胞因子基因表达的影响：于28℃、12℃及0℃暴露24h后，大鼠DMVECs相关因子mRNA表达的变化结果如下：①VEGFmRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为0.86±0.04、1.04±0.04和0.64±0.01，其中28℃组和12℃组较37℃组（0.64±0.01）表达上调（P＜0.05），且两组间存在一定差异（P＜0.05），0℃较37℃无明显改变。提示，28℃及12℃可促进大鼠DMVECs中VEGF的基因表达出现不同程度的上调；②AQP-1mRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为1.72±0.04、1.77±0.03及1.37±0.06，28℃组及12℃组较37℃组（1.45±0.04）表达上调（P＜0.05），但两组间无显著差异，而0℃组与37℃组比较无明显改变。提示，28℃及12℃可促进大鼠DMVECs中AQP-1的基因表达上调；③ET-1mRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为0.85±0.04、1.04±0.04和0.45±0.02。12℃组较37℃组表达上调（P＜0.01），0℃组较37℃组（0.87±0.02）表达下降（P＜0.01），而28℃组较37℃组表达无明显改变。提示12℃可促进大鼠DMVECs ET-1的基因表达上调，而0℃则使其表达减少；④ICAM-1mRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为1.24±0.01、1.50±0.04及1.01±0.01。28℃和12℃较37℃（1.04±0.02）表达上调（P＜0.05），且该两组间存在差异（P＜0.05）。提示，28℃组及12℃组可促进大鼠DMVECsICAM-1的基因表达出现不同程度的上调；⑤IL-1β mRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为0.37±0.01、0.38±0.03及0.46±0.02，28℃组、12℃组及0℃组较37℃组（0.67±0.02）表达均出现显著下降（P＜0.01），提示28℃、12℃及0℃均可使大鼠DMVECs IL-1β的表达减少；⑥IL-6mRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为0.89±0.02、1.02±0.03及0.67±0.03，12℃组较37℃组表达（0.89±0.02）显著上调（P＜0.01），0℃组较37℃组表达显著下降（P＜0.01），而28℃组较37℃组表达无明显改变。提示12℃可刺激大鼠DMVECs IL-6mRNA的基因表达上调，而0℃则使其表达减少；⑦TNF-α mRNA在28℃、12℃及0℃的相对表达量分别为0.26±0.02、0.15±0.02及0.21±0.02，28℃组及0℃组较37℃组（0.14±0.01）表达显著上调（P＜0.01），而12℃组较37℃组表达无明显改变，提示28℃及0℃可促进大鼠DMVECs TNF--α的基因表达上调。4.大鼠DMVECs中TRPM8的表达与鉴定：RT-PCR结果显示，在目的产物大小（216bp）的位置可见阳性条带，经测序，该产物与Genebank中褐家鼠TRPM8mRNA的匹配度为98%，证明大鼠DMVECs中存在TRPM8mRNA的表达；免疫荧光双染结果显示，在BSI结合呈阳性的细胞中，存在TRPM8蛋白的表达，证明大鼠DMVECs存在TRPM8蛋白的表达。5. TRPM8参与低温对DMVECs功能影响的机制：在AMTB存在的情况下，于12℃暴露12h后，75μmol/LAMTB组大鼠DMVEC细胞形态出现明显皱缩，提示，TRPM8被阻断后，12℃可引起大鼠DMVECs细胞形态改变；在12℃条件下暴露12h后，VEGF、ET-1、IL-6及TRPM8基因表达情况分别为：①VEGFmRNA在0h对照组、12h对照组、DMSO组、25μmol/L AMTB组及75μmol/LAMTB组的相对表达量分别为0.94±0.01、1.02±0.03、1.02±0.02、0.94±0.01和0.93±0.02。其中，12h对照组及DMSO组较0h对照组表达上调，提示低温暴露模型成功，但25μmol/LAMTB组及75μmol/LAMTB组较DMSO组表达下降（P＜0.05）。提示TRPM8参与了12℃引起的大鼠DMVECs VEGF基因表达上调；②ET-1mRNA在0h对照组、12h对照组、DMSO组、25μmol/L AMTB组及75μmol/L AMTB组的相对表达量分别为0.73±0.03、0.94±0.01、0.96±0.02、0.73±0.01及0.53±0.02。其中，25μmol/L AMTB组ET-1的mRNA表达量较12h组及DMSO组为表达减少；75μmol/L AMTB组mRNA表达量较12h对照组、DMSO组及25μmol/L AMTB组表达显著下降（P＜0.01）。提示，TRPM8参与了12℃引起的大鼠DMVECs ET-1的基因表达上调；③IL-6mRNA在0h对照组、12h对照组、DMSO组、25μmol/LAMTB组及75μmol/LAMTB组的相对表达量分别为0.26±0.03，0.57±0.04、0.62±0.02、0.67±0.01及0.77±0.01。275μmol/LAMTB组较DMSO组表达显著上调（P＜0.01）。提示，TRPM8参与了低温引起的大鼠DMVECs IL-6基因表达上调；④TRPM8mRNA在0h对照组、12h对照组、DMSO组、25μmol/L AMTB组及75μmol/L AMTB组的相对表达量分别为0.54±0.01、0.74±0.01、0.76±0.03、0.67±0.01及0.54±0.01。25μmol/LAMTB组及75μmol/LAMTB组较DMSO组表达下调（P＜0.01）。提示，TRPM8参与了12℃引起的大鼠DMVECs中其自身基因表达上调。结论：1.采用非连续密度梯度Percoll分离法可成功制备大鼠真皮微血管内皮细胞；2.大鼠真皮微血管内皮细胞可在28℃、12℃及0℃作用下在细胞形态、细胞活力、细胞膜完整性及相关细胞因子基因表达调控等方面表现出不同程度的改变。提示低温可以对大鼠真皮微血管内皮细胞相关功能产生直接影响，而大鼠真皮微血管内皮细胞可能具有感知不同低温刺激的能力。3.大鼠真皮微血管内皮细胞具有TRPM8的活性表达，其参与了12℃对细胞相关细胞因子基因表达的影响。4.低温可能通过激活TRPM8调节了大鼠真皮微血管内皮细胞相关细胞因子的表达。