目的探索病证结合痰瘀互结证局部脑缺血再灌注动物模型的构建方法;以成功构建的动物模型为研究对象,采用Q-PCR、Western blot、ELISA等检测技术揭示miRNA-155及其相关信号通路与缺血性脑卒中痰瘀互结证炎症机制的关系。方法(一)痰瘀互结证脑缺血再灌注动物模型的构建和评价将50只SD雄性大鼠按随机数字表法分为正常组10只和高脂组40只,分别以普通饲料和高脂饲料喂养4周。再将高脂组的40只大鼠重新编号,按随机数字表法分为脑缺血再灌注模型组30只和假手术组10只。模型组通过结扎颈总、颈外动脉并插入鱼线阻塞右侧大脑中动脉(MCAO)的方法,构建局部脑缺血再灌注模型;假手术组仅分离血管,不进行结扎及插入鱼线。模型组大鼠在完成造模24小时后进行Zea Longa评分,观察一般体征,眼眶取血检测血脂四项水平、凝血功能改变情况以评价模型。(二)缺血性脑卒中痰瘀互结证炎症反应机制研究按数字表法将脑缺血再灌注模型组大鼠重新随机分为模型组、阿托伐他汀钙片组、丹蒌片组。根据相应的给药方案给药1周后,取材脑组织,计算脑系数;制作病理切片,观察梗死区域组织的病理学改变;取血复测血脂水平和凝血功能;采用Q-PCR技术检测脑组织中miRNA-155、SOCS1和SIRT1 mRNA的表达情况;采用Western blot技术检测脑组织中SOCS1、SIRT1和NF-κ B蛋白的表达情况;采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6的水平,进一步探究miRNA-155及其相关信号通路与缺血性脑卒中痰瘀互结证炎症反应发生机制的关系。结果(一)病证结合痰瘀互结证局部脑缺血再灌注动物模型的构建在4周的高脂血症造模过程中,高脂组日均进食量、饮水量明显低于正常组,差异均显著(P<0.05)。经过10天的喂养后,高脂组大鼠体重低于正常组,差异显著(P<0.05);经过20天及4周的喂养后,两组大鼠体重无明显差异(P>0.05)。经过4周的喂养后,高脂组大鼠反应迟钝,行动变缓,毛色暗黄,失去光泽;TC、TG、LDL-C水平均高于正常组,差异均显著(P<0.05)。以上结果表明高脂血症动物模型复制成功。构建局部脑缺血再灌注模型后,模型组大鼠出现左侧肢体偏瘫,右侧面瘫、上眼睑下垂、眼裂变小,行走呈追尾状,甚至往健康一侧倾倒,精神萎靡,倦卧少动,舌质紫暗,甚至出现瘀点、瘀斑;模型组PT水平低于正常组和假手术组,APTT水平亦低于正常组,差异均显著(P<0.05);各组间FIB水平无明显差异(P>0.05)。造模完成1周后,模型组大鼠脑系数值高于正常组和假手术组,差异均显著(P<0.05);模型组脑细胞增大、变形,结构模糊,细胞核偏居一侧,神经元固缩,甚至死亡。综上结果表明,本研究病证结合痰瘀互结证局部脑缺血再灌注动物模型构建成功。(二)药物干预效应1.血脂四项给药1周后,假手术组、模型组、阿托伐他汀钙片组、丹蒌片组TC、TG、LDL-C水平均仍高于正常组,差异均显著(P<0.05);阿托伐他汀钙片组TC水平低于模型组,而HDL-C水平高于模型组,差异均显著(P<0.05);丹萎片组与模型组比较,血脂四项水平均无明显差异(P>0.05)。2.凝血功能给药1周后,假手术组、模型组、阿托伐他汀钙片组APTT水平仍低于正常组,差异均显著(P<0.05);丹萎片组APTT和PT水平高于模型组,差异均显著(P<0.05);阿托伐他汀钙片组与模型组比较,APTT、PT水平无明显差异(P>0.05);各组间FIB水平均无明显差异(P>0.05)。(三)miRNA-155及其相关因子与缺血性脑卒中痰瘀互结证炎症反应的关系1.大鼠血清中炎症因子(TNF-α、IL-6)的表达假手术组和模型组的TNF-α、IL-6水平明显高于正常组,差异均显著(P<0.05);模型组TNF-α和IL-6水平明显高于假手术组,差异均显著(P<0.05);阿托伐他汀钙片组TNF-α、IL-6水平低于模型组,丹蒌片组TNF-α水平亦低于模型组,差异均显著(P<0.05)。2.大鼠脑组织中NF-κ B蛋白的表达模型组NF-κ B蛋白表达水平明显高于正常组和假手术组,差异均显著(P<0.05);丹蒌片组NF-κ B蛋白表达水平低于模型组,差异显著(P<0.05);阿托伐他汀钙片组与模型组比较,NF-κ B蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)。3.大鼠缺血脑组织中miRNA-155、SOCS1和SIRT1 mRNA的表达假手术组miRNA-155表达水平高于正常组,而SOCS1 mRNA表达水平低于正常组,差异显著(P<0.05);模型组miRNA-155表达水平高于正常组和假手术组,而SOCS1和SIRT1 mRNA表达水平低于正常组和假手术组,差异均显著(P<0.05);阿托伐他汀钙片组和丹蒌片组miRNA-155表达水平低于模型组,阿托伐他汀钙片组SOCS1和SIRT1 mRNA表达水平高于模型组,丹蒌片组SOCS1 mRNA表达水平亦高于模型组,差异均显著(P<0.05)。4.大鼠脑组织SOCS1、SIRT1蛋白的表达假手术组和模型组SOCS1、SIRT1蛋白表达水平低于正常组,差异均显著(P<0.05);模型组SIRT1蛋白表达水平亦低于假手术组,差异显著(P<0.05);阿托伐他汀钙片组和丹蒌片组SOCS1、SIRT1蛋白表达水平高于模型组,差异均显著(P<0.05);蛋白变化趋势与基因变化趋势基本一致。结论(一)采用高脂饲料喂养结合大脑中动脉栓塞的方法可以在SD雄性大鼠体内成功构建痰瘀互结证局部脑缺血再灌注动物模型。(二)在高脂血症的基础下发生脑缺血再灌注后,大鼠体内可出现明显的炎症反应,同时miRNA-155表达和NF-κ B活化水平升高,SOCS1、SIRT1基因和蛋白表达水平降低。其可能机制是:当脑缺血损伤后miRNA-155被迅速激活,然后通过靶向抑制SOCS1和SIRT1 mRNA的表达,从而调控NF-κ B介导的炎症信号通路,促进体内炎症因子的的生成和释放,加重脑组织损伤。(三)炎症反应是中医学上“痰”和“瘀”的生物学基础之一,降脂类药物以及活血化瘀类药物可以有效降低大鼠脑缺血后的炎症因子水平,其实现途径可能与miRNA-155相关信号通路有关。