独特的化学和生物学特性使得非天然氨基酸成为重要的精细化工原料和医药中间体。D-氨基酸是天然氨基酸的“非天然”对映异构体,含有D-氨基酸的抗生素和药物具有更长的半衰期。N-甲基化氨基酸是多种生物活性分子的重要组成成分,在制药和精细化工等领域应用广泛。相较于传统的化学合成,生物法为非天然氨基酸的合成提供了绿色、高效、经济的新途径。多酶级联反应能将连续的生物催化反应结合起来,实现从简单前体到高附加值化学品的转化。目前L-氨基酸通过发酵生产,年产量巨大且成本低廉,是极具吸引力的生物基化学品。基于上述情况,本研究设计了一个从L-氨基酸出发合成D-氨基酸和N-甲基化氨基酸的多酶级联催化体系,实现非天然氨基酸的绿色、可持续生产。主要研究结果如下:1.级联催化体系设计。设计的级联催化体系包含L-氨基酸的氧化脱氨反应和中间产物α-酮酸的还原胺化反应,并在还原胺化模块中引入辅酶NADPH再生系统。构建的两条催化路线分别用于L-氨基酸上氨基基团的手性反转和N-甲基化。结合文献报道,筛选性能优异的酶进行各模块的催化反应,分别为祖先L-氨基酸氧化酶（Anc LAAO,氧化脱氨）、来源于Symbiobacterium thermophilum的二氨基庚二酸脱氢酶和来源于Pseudomonas putida的N-甲基氨基酸脱氢酶（St DAPDH和NMAADH,还原胺化）以及来源于Burkholderia stabilis的甲酸脱氢酶（Bs FDH,辅酶再生）。2.以纯化酶为催化剂,进行级联反应各模块的组装。经过反应条件优化,分别以甲酸铵和甲胺为胺供体,100 m M的L-苯丙氨酸均能完全转化为对应的产物D-苯丙氨酸和N-甲基-L-苯丙氨酸,产率为100%,D-苯丙氨酸ee＞99%。除L-苯丙氨酸外,该级联催化体系能将L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸和L-酪氨酸转化为对应的D型氨基酸,产率为5.47-99.4%,产物ee＞99%;能将L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸转化为对应的N-甲基-L-氨基酸,产率为47.2-99.5%。3.以全细胞为催化剂,进行体内级联反应构建。将St DAPDH（或NMAADH）和Bs FDH在E.coli中共表达。每条催化路线分别设计了三种共表达菌株,筛选出具有较高催化活性的菌株作为还原胺化模块催化剂。使用全细胞催化剂进行级联反应,优化反应条件和各模块催化剂的添加量,全细胞催化50 m M的L-苯丙氨酸反应,D-苯丙氨酸的产率最高为63%,ee＞99%;N-甲基-L-苯丙氨酸的产率最高为85%。对N-甲基-L-苯丙氨酸合成路线的全细胞催化剂用海藻酸钠进行包埋固定,产率提升至93%,循环三次后产率为60%。本研究构建了由L-氨基酸合成D-氨基酸和N-甲基-L-氨基酸的多酶级联催化体系,建立了非天然氨基酸的生物合成新途径。