棉花是重要的纤维和油料作物,能提供天然纺织纤维材料,丰富蛋白质和油料。棉花具有明显的杂种优势,杂交后代在生长活力、生物量和纤维产量等方面都强于双亲,杂种优势的利用能显著提高棉花产量和纤维品质。目前棉花育种方式主要是通过三系(不育系、恢复系、保持系)配套系统利用杂种优势进行育种。然而在杂种优势利用研究中,棉花育性相关功能基因的研究比较缓慢,育性相关基因功能和分子机理尚不清楚。本文以陆地棉(Gossypium hirsutium L.)雄性不育突变体ms1和陆地棉野生型C312(ms1的背景植株)为硏究对象,对其花药发育早期、中期和晚期三个不同发育时期进行转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq),基于转录组数据,系统挖掘突变体不育性形成的相关差异表达基因。然后应用生物信息学、遗传学和分子生物学等方法,解析棉花雄性不育相关基因的功能和调控机理。具体包括运用q RT-PCR技术对转录组和差异表达极其显著的育性相关基因进行验证,筛选与育性相关的候选基因;利用生物信息学分析候选基因Gh OLE9编码蛋白(Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase)的性质、结构、功能;基于病毒介导遗传转化体系CLCr V载体系统构建病毒干涉载体p CLCr VA-Gh OLE9,利用农杆菌侵染法沉默陆地棉内源Gh OLE9基因,并对转基因干涉株系进行表型分析(花粉活性检测,花药发育组织观察,自花授粉结铃性等),基因表达分析;同时构建PK7GWIWG2(I)-Gh OLE9干涉载体,通过农杆菌介导侵染棉花下胚轴及胚性愈伤,建立棉花转基因再生体系,获得再生Gh OLE9干涉转基因植株,进行Gh OLE9功能分析和不育材料的创制。主要研究结果如下:(1)对陆地棉野生型C312和雄性不育突变体ms1的花器官表型分析,发现在花药发育早期,花器官形态几乎没有差异;但在花药发育后期,突变体的柱头明显长于野生型,柱头裸露,花药未开裂时就表现出萎缩、干瘪、畸形,花丝短;在开花当天突变体花药干瘪不开裂,无花粉散出。(2)对陆地棉野生型C312和雄性不育突变体ms1不同发育时期花药的转录组进行分析,在发育早期、中期和晚期,分别鉴定了3355,7002,7415个差异表达基因。对差异基因进行GO功能分类和KEGG通路富集,多涉及在碳水化合物代谢,氨基酸代谢、类黄酮代谢、脂肪酸代谢、信号转导等代谢途径。(3)对转录组进行q RT-PCR验证,结果显示q RT-PCR数据与转录组数据相一致,表明转录组数据是可靠的。同时在q RT-PCR和转录组中验证了关于果胶裂解酶和果胶酯酶基因的表达量,发现在雄性不育突变体中均显著下调,推测这些基因的下调表达影响果胶的降解,进而影响花粉发育。(4)对Gh OLE9基因进行生物信息学分析,Gh OLE9基因为405 bp,编码134个氨基酸,在第49位至133位氨基酸序列之间有一个X8结构域,该结构域能识别并结合β-1,3-葡聚糖的碳水化合物,是糖基水解酶家族GH-17的保守结构域。推测编码的蛋白属于糖基水解酶第17家族,是β-1,3-葡聚糖酶,具有水解β-1,3-葡聚糖的功能。前期研究表明β-1,3-葡聚糖酶在花药发育中通过胼胝质代谢途径来调控花粉发育,或是参与花粉萌发过程中花粉壁的重组。因此,我们对Gh OLE9基因在棉花花粉发育中的功能展开研究。(5)对Gh OLE9基因的表达模式进行分析,发现该基因在陆地棉XC20和C312的雄蕊、柱头等生殖器官中特异表达,且在突变体ms1花药中的表达量明显低于C312,推测该基因在棉花花药发育过程中起着重要作用。(6)利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默基因Gh OLE9,发现10株阳性植株,6株Gh OLE9干涉株系开花当天棉花花药干瘪,数量少,不散粉;花粉稀少,畸形无活力,四分体时期小孢子发育异常,胼胝质增厚。利用q RT-PCR技术,对其中4株表型明显且稳定的干涉株系进行检测,发现在干涉株系(开花当天)雄蕊中的表达量显著甚至极显著降低。Gh OLE9干涉株系的其他表型与对照植株相比没有明显差别,Gh OLE9基因沉默并不影响棉花植株除育性外其它的农艺性状。研究结果初步表明:Gh OLE9基因在棉花花药发育过程中发挥重要的作用。(7)构建PK7GWIWG2(I)-Gh OLE9干涉载体,通过农杆菌介导侵染陆地棉YZ1和S1下胚轴及胚性愈伤组织,已获得转基因胚性愈伤组织及植株,正在进行分子生物学鉴定和农艺性状分析。结果表明:陆地棉野生型C312和雄性不育突变体ms1不同时期花药的差异表达基因主要集中在碳水化合物代谢,氨基酸代谢,类黄酮代谢等途径中,表明这些代谢途径参与棉花花药的发育,调控棉花育性。同时发现陆地棉Gh OLE9基因表达量的下调,将导致棉花四分体时期胼胝质增厚,小孢子发育异常,其通过胼胝质代谢来影响植株育性,其具体功能还需进一步深入开展。