GhIAA27基因在陆地棉体细胞胚胎发生中的功能研究

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棉花是世界上主要的经济作物,利用转基因技术对棉花种质资源创新,极大地提高了棉花的纤维品质和产量。作为棉花转基因技术的理论基础,棉花的体细胞胚胎发生仍存在问题,主要的技术瓶颈是如何提高该过程中愈伤组织转化为胚性愈伤组织的效率。因此寻找这一转化过程中的关键调控基因就显得尤为重要。本文在实验室前期研究的基础上,首先从陆地棉JH713的胚性愈伤组织中克隆了一个基因GhIAA27,然后构建过表达载体pCAMBIA2300-GhIAA27-GFP和干涉载体pCAMBIA2300-RNAi-GhIAA27,最后利用农杆菌介导法将GhIAA27基因转入烟草、拟南芥和棉花研究其在陆地棉体细胞胚胎发生中的功能,取得以下实验结果:(1)GhIAA27定位在细胞核中,GhIAA27过表达拟南芥植株表现出高生长素积累表型。首先利用农杆菌介导法将过表达载体转化本氏烟草,进行GhIAA27的亚细胞定位分析,实验结果表明GhIAA27定位在细胞核中。然后利用蘸花法表达载体转化拟南芥,目前已拿到T3代稳定遗传的转基因拟南芥植株。观察表型发现,和野生型拟南芥相比,GhIAA27过表达拟南芥植株的叶片呈下卷曲状,发育早期株高降低,发育后期分枝数增多,角果变短。(2)愈伤组织诱导阶段,GhIAA27干涉的愈伤组织生长最快。利用农杆菌介导法将空载体、过表达载体和干涉载体分别转化CCRI12(难再生)和JH713(易再生)。实验结果表明:在愈伤组织诱导阶段,CCRI12和JH713中GhIAA27干涉的愈伤组织生长量都大于转空载体的愈伤组织生长量,GhIAA27过表达的愈伤组织生长量都小于转空载体的愈伤组织生长量。故本文认为愈伤组织诱导阶段,GhIAA27基因可能起负调控的作用。(3)胚性愈伤组织诱导阶段,GhIAA27干涉的愈伤组织转化为胚性愈伤组织的速度明显加快,且胚性愈伤分化率明显提高。实验结果表明:CCRI12和JH713中GhIAA27干涉的愈伤组织都最先开始转化为胚性愈伤组织;CCRI12中转空载材料、GhIAA27过表达材料和GhIAA27干涉材料的胚性愈伤分化率分别为8.03%、3.87%和14.93%;JH713中转空载体材料、GhIAA27过表达材料和GhIAA27干涉材料的胚性愈伤分化率分别为46.07%、23.11%和70.1%;诱导9个月后,JH713的GhIAA27干涉材料最先得到阳性的再生苗。故本文认为胚性愈伤组织诱导阶段,GhIAA27基因可能起负调控的作用。(4)为了探究GhIAA27蛋白的调控机制,通过酵母双杂交实验筛选到一个生长素早期响应基因GhARF8,通过点对点验证和荧光素酶互补实验,初步证明了GhIAA27和GhARF8存在互作关系。综上所述,本文认为在现有的实验条件下,GhIAA27基因在陆地棉体细胞胚胎发生中起负调控的作用。
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