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第一部分 B7.1、B7.2、4-1BBL基因真核表达载体体系和pcBHA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子的构建及目的基因在鼠肝癌细胞系中表达的实验研究 目的 构建含鼠源性B7.1、B7.2和4-1BBL基因真核表达载体体系和pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子，使目的基因在小鼠原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞系H22中获得稳定、高效表达。 方法 1、将B7.1、B7.2和4-1BBL全长cDNA亚克隆到真核表达载体PCI-neo中，获得目的基因定向插入重组子PCI-neo-B7.1、PCI-neo-B7.2和PCI-neo-4-1BBL，酶切和测序法鉴定。同法构建pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子，酶切法鉴定。 2、用阳离子脂质体将重组子转染H22，经G418筛选，获得阳性克隆，分别命名为H22-CD80+细胞、H22-CD86+细胞、H22-CD137L+细胞、H22-CD80／CD86+细胞和H22-CD80／CD86／CD137L+细胞。逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和流式细胞仪(flow cytometer, FCM)检测目的基因在H22变异株的表达。 结果 1、PCI-neo-B7.1／B7.2／4-1BBL酶切后，电泳显示862bp、984bp和980bp目的基因片段和5.4kbp线性化PCI-neo载体片段；重组子测序结果与Genebank中B7.1、B7.2和4-1BBL cDNA序列相符，证实构建成功。勤京医科大学博士学位论又 2、pCDNA3.1一B7.卜IRES一B7.2重组子经酶切鉴定，同时获得B7.1(862bp)和B7.2(984bp)目的基因片段和5.6 kbp线性化pCDNA3.1载体片段，证实构建成功。 3、RT一PCR检测结果显示B7 .1、B7.2和4一IBBL基因分别在!122一CD80+细胞、H22一CD86+细胞和H22一CDI 37L+细胞中获得稳定、高攻表达。 4、RT一PCR检测结果显示B7.l、B7.2基因在H22一CDSO/CD86+细饱中获得稳定、高效联合表达。 5、FCM检测B7.1、B7.2和4一IBBL基因H22一CD80/CD86/CD137L+细胞中获得稳定、高效联合表达。 结论 B7.1、B7.2和4一IBBL真核表达载体体系和peDNA3.l一B7.1一xREs一B7.z重组子构建正确，目的基因在H22变异株中获得稳定、高效表达。 第二部分 B7.1、B7.2和4-IBBL基因联合表达对H22一BALBI。卜鼠肝疮种植模型肿瘤免疫原性和体内增殖的影响目的 建立H22一BALB/C小鼠肝癌种植模型，对B7.l、B7.2和4一1 BBL基因联合表达对肿瘤免授原性和体内增殖情况的影响进行研究。 方法 1、BALB/c，卜鼠随机分成5组。A组接种H22一Wt细胞;B组接种H22一neo细胞;C组接种H22一CD80/CD86+细胞;D组接种日22一CD137L+细胞:E组接种H22一CDSO/CD86/CD137L+细胞，建立H22一BALB/C小鼠荷肝癌模型，A、B组为对照组。 2、观察小鼠成瘤率、成瘤潜伏期、荷瘤鼠存活率及肿瘤增殖情况。通过复种试验观察转基因对H22变异株免疫原性和机体免疚保南京医科大学博士学位论又护作用的影响。 王于接种后第!4d、第35d、第56d和第84d，行同源淋巴细胞和肿瘤细胞混合培养(MTLCS)，MTT法测定淋巴细胞增殖指数，乳酸脱氢酶(LDH)法检测CTLS活性，ELISA法检测培养上清中细胞因子IL一2、IFN一v表达，RT-PCR法检测肿瘤组织中IL一2、IFN一Y、ICAM一1、TNF一。和丁NF一a受体11 mRNA表达，探讨转基因对免疫应答的影响。结果 l、成功建立H22一BALB/c小鼠肝癌种植模型。A、B、C、D四组小鼠成瘤率均为】00%，而E组首次接种成瘤率仅有50%，与其余四组有显著差异(尸<0.01);各组成瘤潜伏期依次为:A组6士l.Zd，B组5 .5士1 .4d，C组1 3.9士3.ld，D组14.2士2.9d，E组14.9士2.0d，C、D和E组成瘤潜伏期无明显差异(尸>0.05)，均显著长于对照组 (P(0 .01)。 2、首次接种后，A、B、D组荷瘤鼠肿瘤呈进行性生长，总生存期约为5一7w。在120d观察期内，C组荷瘤鼠肿瘤生长受到明显抑制，有2只荷瘤鼠(20%，2/10)肿瘤完全消退。E组肿瘤生长受到较C组更为明显的抑制，肿瘤峰值体积显著小于C组(尸<0.05)，且5只荷瘤鼠中共有3只(60%，3/5)肿瘤完全消退。其余三组中荷瘤鼠未见肿瘤完全消退。 3、与A、B、D组相比，C、E组荷瘤鼠生存率显著改善(尸<0.01)，但C、E两组荷瘤鼠生存率未见显著差异(尸>.05)o 4、采用相同接种方法，各组荷瘤鼠均于第Zld对侧肢体重复接种H22一Wt细胞，A、B两组均1 00%再次成瘤(8/8，2/2)，C组40%再次成瘤(4/10)，D组100%再次成瘤(8/8)，E组成瘤率为0(O/5)。0组与对照组无明显差异，C、E组与对照组有显著差异，E组与C组也有显著差异(尸<0.01)。 5、C、E两组再次接种未成瘤小鼠，于首次接种后第56d，第三次接种野生型H22，C组成瘤率100%(6/6)，E组成瘤率为O(0/5)，E组成瘤率显著低于C组(尸<0.01)。 6、E组中5只首次接种未成瘤小鼠，第21d重复接种H22一Wt，南京医科大学博士学位论又苛瘤鼠100%排斥肿瘤，于第56d第三次接种H22/Wt，荷瘤鼠仍然100‘儿才非斥月中瘤。 7、E组有1只荷瘤鼠在首次接种第56d后，肿块体积减小后重新增大，检测此?