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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根和根茎是我国传统的大宗药材,也是利用现代医学技术进行多方面研究的主要中药之一。丹参中最主要的药用成分为脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的丹酚酸类化合物。随着研究的不断深入,丹酚酸类成分的生物合成通路不断得到解析,但是丹酚酸B合成通路的下游途径仍未明确。有学者推测漆酶催化迷迭香酸（RA）生成丹酚酸B（Sal B）。漆酶（Laccase）是一种多铜氧化酶,在植物中可以参与木质素聚合、抵抗胁迫等过程。目前植物漆酶的研究主要在模式植物和经济作物中,药用植物丹参中漆酶的相关研究报道较少。已知丹参根中丹酚酸类成分高于其他部位,实验室前期研究结果显示,丹参漆酶基因Sm LAC26在根中表达水平远高于其他部位。基于此,本研究选择Sm LAC26作为研究对象,系统研究Sm LAC26的表达模式、亚细胞定位以及在丹参中的功能,明确其是否参与丹酚酸类成分的生物合成。本研究主要内容及结果如下:1.利用PCR技术扩增得到了Sm LAC26的全长序列。Sm LAC26开放阅读框序列长为1704 bp,编码567个氨基酸,含有漆酶特有的4个结构域。通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）分析Sm LAC26在丹参不同部位的表达模式以及对4种外源激素（ABA、GA3、IAA、Me JA）的响应,结果显示:Sm LAC26在根中的表达量远远高于茎、叶、花这3个部位,并且Sm LAC26可以响应4种激素的处理。2.通过双酶切法将Sm LAC26构建至亚细胞定位载体p HBT-GFP-NOS,获得pro35S::Sm LAC26-GFP融合表达载体,并利用PEG-Ca2+介导转化法,将重组载体转入拟南芥原生质体进行瞬时表达,在荧光显微镜下观察荧光,结果表明,Sm LAC26主要定位在叶绿体中。3.克隆得到Sm LAC26基因5’端1301 bp的启动子区,顺式作用元件分析显示,Sm LAC26启动子区包含脱落酸、生长素响应元件和部分光响应元件。利用双酶切法将Sm LAC26启动子区构建至具有GUS标签的p CAMBIA1391Z载体,并通过农杆菌GV3101介导的花序侵染法获得pro Sm LAC26::Gus转基因拟南芥。用潮霉素抗性筛选阳性株系至T2代后进行GUS组织化学染色,结果显示,在不同时期的转基因拟南芥中均可以检测到较强的GUS信号,并且根中的信号比其他部位强。4.利用双酶切法将Sm LAC26的c DNA构建至包含GST标签的原核表达载体p GEX-4T-1,将重组质粒转化至Arctic宿主细胞后,加入IPTG于16℃低温诱导16 h,SDS-PAGE电泳检测结果显示,目的蛋白在上清中有大量表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,获得了纯度较高的融合蛋白。5.利用GATEWAY技术将Sm LAC26的c DNA构建到p Earley Gate202和p K7WG2R载体,分别获得Sm LAC26过表达载体p Earley Gate202-Sm LAC26和p K7WG2R-Sm LAC26。通过根癌农杆菌EHA105介导的叶盘转化法将p Earley Gate202-Sm LAC26转入丹参叶片,经抗性筛选及DNA、RNA水平验证后获得7个Sm LAC26过表达丹参株系。通过发根农杆菌ATCC15834介导的遗传转化法将p K7WG2R-Sm LAC26转入丹参,利用抗性筛选发根,并采取荧光鉴定和DNA、RNA水平检测的方法验证转基因毛状根,最终获得5个Sm LAC26过表达毛状根株系。6.根据RNA水平检测结果在转基因植株及毛状根中各选择Sm LAC26转录水平较高的3个株系,通过高效液相色谱法测定过表达植株（26O-2、26O-5和26O-7株系）和过表达毛状根（OE-2、OE-4和OE-5株系）中丹酚酸类成分的含量。结果显示,26O-2、26O-5和26O-7的根中RA和Sal B的含量均显著减少,26O-2中含量变化最大,其RA和Sal B含量分别比对照（CK）中的含量降低了68.15%和93.48%。OE-2、OE-4和OE-5转基因毛状根中RA和Sal B含量也低于CK,含量变化最大的OE-2中RA和Sal B分别约比CK降低了45.65%和77.92%。转基因丹参植株和转基因发根含量测定结果表明,Sm LAC26抑制丹酚酸类成分的合成。7.利用木质素含量测定试剂盒检测转基因丹参植株和转基因毛状根中的木质素含量。结果显示,转基因植株26O-2、26O-5和26O-7的根中木质素含量均显著升高,分别比CK高34.8%、38.0%和44.9%。转基因毛状根OE-2、OE-4和OE-5中木质素含量也高于对照株系,含量变化最大的OE-2中木质素含量约比CK高26%,表明Sm LAC26对木质素生物合成具有促进作用。8.通过q RT-PCR测定转基因植株根中及转基因毛状根中酚酸类物质和木质素合成途径上关键酶基因的表达水平。结果显示,在转基因植株26O-2、26O-5和26O-7中,丹酚酸合成通路上Sm4CL1、Sm TAT1、Sm HPPR1和Sm RAS1的表达量显著下调,木质素合成通路上Sm CCR和Sm COMT的表达水平显著上调。在转基因毛状根OE-2、OE-4和OE-5中,丹酚酸合成通路上Sm4CL1、Sm TAT1、Sm HPPR1、Sm RAS1和Sm CYP98A14的表达量均显著下调,且木质素合成通路上Sm CCR和Sm COMT的表达水平上调。说明过表达Sm LAC26可以使木质素合成通路上的多个酶基因的表达上调,但丹酚酸类成分合成途径上多个酶基因的表达下调,从而增加木质素的积累,减少丹酚酸类物质的合成。