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本课题旨在探讨小鼠胚胎发育的各个时期细胞内钙释放受体的表达及功能的动态变化,进一步揭示在胚胎发育的各个时期,尤其是发育早期心肌细胞内钙活动的特点、与先天性心脏病发生发展的关系,进而为其防治提供相关的理论依据。研究的内容包括:系统的检测了胚胎发育各个时期钙释放受体IP3R和RYR在胚胎发育阶段的空间定位分布情况;发育时期IP3受体和RYR受体的表达情况,并进行表达水平的相对定量:同时结合荧光测钙的技术检测了胚胎发育各个时期心肌细胞内钙释放动力学的动态变化。采用实时荧光定量PCR、电子显微镜、膜片钳结合激光共聚焦显微镜联合测钙以及免疫荧光对钙释放受体空间共定位的方法,主要得出以下结果:
1.钙释放的动力学观测显示发育早期钙火花的发放频率较低,主要以钙波和整体性的钙释放的形式出现,钙释放动力学参数(空间半高宽,上升时间,半衰时间)的分析表明IP3R参予心脏发育早期的兴奋收缩偶联过程:
2.空间共定位的结果显示在胚胎发育的极早期(e8.5,e9.5)IP3R在整个细胞里高水平表达,RYR在细胞质里低水平表达且不连续。从发育的e10.5天开始RYR开始在细胞质里连续分布并随着发育进程表达量逐渐升高,随着细胞质体积的增大而增多。IP3R表达下调并逐渐集中分布于核膜和胞间连隙处;
3.小鼠胚胎心肌细胞发育各个时期电镜观察发现,肌质网与细胞膜之间的距离小于50nm,也为胚胎发育期存在钙诱导的钙释放提供了空间证据:
4.实时荧光定量PCR的结果显示:胚胎发育早期IP3R的表达量比较高,而RYR的表达量比较低,伴随着发育过程,IP3R的表达量逐渐下调而RYR的表达量逐渐上调,免疫荧光的检测也证明了这一点:
基于以上的研究结果我们得出以下结论:1)在胚胎发育期的小鼠心肌细胞中兴奋收缩偶联的机制是存在的,但是它有很多不同于成年期心肌细胞的特点2)在胚胎发育最早期(e8.5,e9.5)已经有RYR受体的表达同时开始行使钙释放的功能,随着发育得进行RYR受体的表达量逐渐升高同时钙释放的作用也逐渐增强。同时IP3R受体在整个发育阶段都参与了钙释放的过程并发挥了重要的作用。