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目的:研究葡萄膜黑色素瘤组织及不同侵袭性人葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma,UM)细胞系MUM-2B、C918和OCM-1A中骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的表达情况,并进行细胞功能实验,分析OPN的组织及细胞系mRNA表达水平与葡萄膜黑色素瘤患者临床病理特征、侵袭潜能和转移预后之间的关系。
方法:
(1)收集2004年1月至2007年12月在北京同仁医院行眼球摘除手术并已经病理证实为葡萄膜黑色素瘤组织的标本共50例,应用免疫组织化学法检测石蜡标本中OPN的表达,分析其与临床资料的相关性。
(2)体外培养人UM细胞系MUM-2B、C918和OCM-1A,运用Q-PCR技术检测这三种不同侵袭性的人葡萄膜黑色素瘤细胞系中OPNmRNA的表达情况。
(3)构建OPN沉默慢病毒表达载体,转染人UM细胞系MUM-2B、C918,并运用Q-PCR以及Western Blot法进行表达验证实验。
(4)运用MTT法检测UM细胞转染前后人UM细胞系MUM-2B、C918增殖能力的变化。
(5)运用Transwell实验检测转染前后人UM细胞系C918细胞侵袭能力的变化。
结果:
(1)50例葡萄膜黑色素瘤组织中发生肝转移者13例,其中10例OPN表达阳性,未发生肝转移的37例中14例OPN表达阳性;上皮型与非上皮型葡萄膜黑色素瘤OPN表达阳性者分别为11/15和13/35;肿瘤累及睫状体和未累及者OPN表达阳性者分别为30/20和4/20:上述指标的比较差异均有统计学意义(x2=5.888、5.510、10.470,P＜0.05)。患者不同性别、年龄、眼别、肿瘤最大基底径以及是否侵犯巩膜导管间OPN表达阳性例数的比较差异均无统计学意义(P=0.536、0.256、0.802、0.848、0.555)。
(2)人UM细胞系由高侵袭性到低侵袭性依次为MUM-2B、C918、OCM-1A,其OPN mRNA相对表达量分别为1.00±0.04;0.91±0.03;0.08±0.01,差异有统计学意义(F=33.135,P＜0.05),MUM-2B、C918中OPN mRNA的表达水平较OCM-1A中明显增高,差异均有统计学意义(P=0.00),而MUM-2B、C918中OPN mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.804)。
(3)OPN沉默慢病毒表达载体转染UM细胞系MUM-2B、C918,转染效率为80%,且转染后检测细胞较转染前细胞OPN蛋白以及OPN mRNA表达水平明显下降,靶基因敲除效果显著(P＜0.01)。
(4)UM细胞系C918转染沉默慢病毒表达载体后细胞增殖能力较空白组以及阴性对照组明显下降;UM细胞系MUM-2B转染沉默慢病毒表达载体后细胞增殖能力较空白组以及阴性对照组相比略微下降。
(5)转染OPN沉默慢病毒表达载体,OPN沉默表达后UM细胞系C918细胞侵袭能力较空白组以及阴性对照组下降。
结论:OPN与葡萄膜黑色素瘤转移潜能及侵袭能力密切相关,发生转移的葡萄膜黑色素瘤组织及高侵袭性细胞系中OPN表达水平明显升高,OPN沉默表达后UM细胞增殖能力以及侵袭能力较转染前下降,提示OPN可能作为预测葡萄膜黑色素瘤侵袭能力、转移潜能以及患者预后的指标。