细胞周期素D1，是细胞周期G1期的关键蛋白，它感应细胞外界刺激，在细胞从G1期转变到S期的过程中起重要作用。细胞周期素D1与CDK4／6形成激酶复合物，这个激酶复合物磷酸化Rb蛋白，释放出E2F从而促进细胞周期进入S期。细胞周期素D1基因在肿瘤细胞中高表达。由于细胞周期素D1是一个细胞周期关键基因，因此它被认为是肿瘤的治疗和检测的标志基因之一，它的调控机理也一直是研究的热点。热疗也是肿瘤治疗的方法之一。热休克条件下的基因表达调控以热休克蛋白如HSP90等的调控机制研究的最为深入，而其他基因在热休克条件下的表达调控机制还不是很清楚。本研究探讨的是细胞周期素D1基因在热休克条件下的表达调控机制，它不但在基础理论上同时在实际应用中也有着一定的意义。 1．报告基因活性分析结果显示细胞周期素D1基因启动子-39～-30位的NF-κB 位点是热休克的应答元件。 1．1删切和突变的细胞周期素D1基因启动子驱动的能模拟染色质状态的pREP4-m-CAT报告基因表达质粒的构建。“全长”的细胞周期素D1基因启动子报告基因质粒(pREP4-m-1745CD1-CAT)，选取酶切位点从5’端删切构建一系列5’删切质粒。应用Asp718／AfI Ⅱ酶切，然后用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片断补平3’凹端，构建了从下游-1236bp到+141bp的删切质粒，记为pREP4-m-1236CD1-CAT。应用Kpn I和Sph I酶切，然后用T4噬菌体DNA聚合酶削平3’突出端，构建了从下游-580bp到+141bp的删切质粒，记为pREP4-mV580CD1-CAT。设计引物，应用PCR方法，构建了从下游-50到+141bp的删切质粒，记为pREP4-m-50CD1-CAT。应用搭桥PCR方法构建了“全长”在-39～-30NF-κB位点突变的细胞周期素D1基因启动子报告基因质粒，记为pREP4-m-1745CD1-nf-CAT。同时应用PCR方法构建了从下游-50到+141bp并且-39～-30NF-κB位点突变的删切质粒，记为pREP4-m-50CD1-nf-CAT。 1．2应用竞争性半定量RT-PCR报告基因活性分析的方法确定细胞周期素D1基因启动子的热休克应答元件。在热休克条件下，细胞周期素D1的mRNA水平下降。将在pREP4-m-CAT载体上构建了的“全长”的(-1745～+141)，删切的(-1236～+141，-580～+141，-50～+141)以及-39～-30位的NF-кB位点突变的细胞周期素D1基因启动子的报告基因质粒，与内参照质粒pM-CAT共转染A549细胞，热休克处理后，应用竞争性RT-PCR方法分析报告基因活性，结果显示，和对照组(生理条件)相比，在“全长”以及删切报告基因质粒均表现出热休克效应：活性下降50％；而-39～-30位的NF-кB元件突变后热休克效应消失，说明-39～-30位的NF-кB是热休克应答元件。 2． 应用染色质免疫沉淀(ChIP)技术，分析转录因子在-39～-30位点结合情况。 实验选用抗体为抗P65，mSin3A，BRM，P53，Ac-H3K9，P300和PCAF。结果显示，和对照(生理条件)相比P65的结合活性没有改变，而mSin3A,P53结合活性上升。Ac-H3K9结合活性下降。mSin3A是HDACl，2等的共阻遏物，组蛋白乙酰化下降，说明P65在热休克后募集了去乙酰化酶造成组蛋白乙酰化下降，从而抑制转录活性。P53的结合活性上升，说明p53也参与了这一抑制过程。P300和PCAF结合活性没有改变，可能二者并不参与细胞周期素D1基因启动子的热效应调节。 3．P65，TSA，HDAC，P53和BRM等对细胞周期素D1启动子报告基因活性的影响。 应用共转染技术分析启动子活性，分析-39～-30位的NF-кB的作用机制。实验表明共转染P65并不能阻止细胞周期素D1基因启动子的热休克效应。转染P65可以增强报告基因活性，但是并不能改变热休克造成的启动子活性的下降。而FSA，HDAC类的抑制剂却能逆转这一效应。共转染HDACl，HDAC2表达质粒分别可以抑制细胞周期素D1基因启动子活性到60％和40％。说明HDACs能够抑制细胞周期素D1基因启动子活性，可以参与细胞周期素D1基因启动子的热休克效应调节。共转染p53表达质粒和细胞周期素D1基因启动子的-50～+141区段，以及这一区段中-39～-30位的NF-кB位点突变的质粒，结果表明P53抑制细胞周期素启动子活性，当-39～-30位的NF-кB位点突变后抑制效应消失，说明P53抑制细胞周期素启动子并且和-39～-30位的NF-кB位点相关。用“全长”的以及“全长”突变的细胞周期素D1基因驱动的报告基因质粒共转染染色质重塑复合物ATP酶亚基BRM野生型(Wt-BRM)以及突变型质粒(DN-BRM)，结果显示BRM促进细胞周期素D1基因启动子活性，热休克时抑制细胞周期素D1基因启动子活性。而这一效应在-39～-30位的NF-кB突变后消失，说明BRM的作用和此位点相关。 综上所述，本研究发现了热休克调控的非经典途径：非HSE／HSF。途径。-39～-30位的NF-κB位点是细胞周期素D1基因启动子热休克应答元件。细胞周期素D1基因启动子的热效应是由P65募集的HDAC造成的。