慢性髓性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是我国最常见的一种慢性白血病,主要见于20岁以上的成年人,尤其以壮年居多。尽管CMI.在慢性期发展缓慢,自然病程可持续5-6年,但是若病情演变则会进入加速期或直接进入急变期。CML一旦发生急性变,患者的存活时间往往只有3-6个月。目前唯一能根治CML的方法是异基因造血干细胞移植,但由于供者来源有限、医疗费用高等因素最终只有不到20％的患者能够进行干细胞移植治疗。CML最重要的细胞遗传学特征是存在特异性的Ph染色体(Philadelphia Chromosome),95％的CML细胞中会存在Ph染色体。Ph染色体是由第9号染色体长臂远端的ABL基因(9q34)和第22号染色体长臂上的BCR基因(22q11)相融合形成BCR-ABL融合基因。CML中表达增强的融合基因BCR-ABL编码一种新的融合蛋白P210BCR-ABL。该融合蛋白具有很强的ABL酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)的活性,能通过激活一些具有促进细胞分裂的蛋白及一些抑制细胞凋亡的蛋白而促进细胞分化,对白血病的发生发展起着重要的作用。近年来随着对CML分子发病机制研究的不断深入,逐渐形成了针对BCR-ABL融合基因及P210融合蛋白的特异分子靶向治疗的新思路,有助于在治疗CML中寻找非移植的根治方法。　　 MicroRNAs(miRNAs)是一类长约23个核苷酸(nt)的内源性的、非编码的单链RNA分子,它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。迄今为止,在动植物中已经发现了数以千个miRNA基因,目前认为在不同物种中,编码miRNA的基因约占蛋白编码基因的1％左右,它们通过与所靶向基因的mRNA的3’UTR区互补结合,实现对靶向mRNA进行切割或者转录后抑制,进而作为一类重要的调控分子,参与对生物体的生长、发育、衰老和死亡的调控。在正常生理状态下,生物体内的miRNAs表达呈严格的组织及发育阶段特异性,如果miRNAs的表达发生失调,则可能会引起各种疾病的发生发展。目前研究人员已经证明miRNAs在多种肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。已经有研究表明,miR-203在CML及部分ALL(acute lymphoblastic leukemia)中通过遗传学和表观遗传学机制导致其在转录水平的沉默,并且导致了其可能的靶基因ABL和BCR-ABL在这些特定血液系统肿瘤中被激活,BCR-ABL融合蛋白表达增加。而再表达miR-203则可减少ABL,蛋白及BCR-ABL融合蛋白的表达,并能抑制肿瘤细胞增殖,这为某些血液系统肿瘤的临床治疗提供了新的思路。　　 本课题基于当前对CML及miRNAs深入研究的基础之上,探讨在CML中是否存在靶向BCR-ABL融合基因的其他miRNAs,并初步筛选鉴定这些miRNAs与融合基因BCR-ABL之间的靶向关系,为进一步研究在CML的发生发展过程中某种或多种miRNAs如何发挥调节机制奠定基础,也期望能通过本课题的研究为临床上对CML进行的干预治疗提供一定思路。　　 本课题首先利用三种不同的生物信息学软件对可能靶向BCR-ABL融合基因的miRNAs进行筛选,然后交集三种预测软件得到的结果,以牺牲预测软件的敏感性而提高预测结果的特异性的方法获取三种预测软件共有的预测结果。然后挑选其中的一个miRNA,并构建特异性表达该miRNA的慢病毒质粒。利用包装细胞对慢病毒质粒进行包装并获取慢病毒上清。以CML的细胞株K562细胞为研究对象,慢病毒上清感染K562细胞,然后通过实时荧光RT-PCT及Western-blot的方法检测感染后K562细胞的miRNA表达及融合蛋白的表达情况,并初步判断所研究miRNAs与BCR-ABL融合基因是否存在靶向关系。　　 本论文主要包括以下三部分内容:　　 第一部分:靶向BCR-ABL融合基因的microRNAs的筛选　　 首先利用TargetScan、Miranda和PicTar三种不同的生物信息学软件对可能靶向BCR-ABL基因的miRNAs进行预测,分别得到了35种、12种和9种miRNAs。然后将这种三种预测软件的结果取交集,得到了miR-30家族(包括miR-30a/30b/30c/30d/30e)为三种软件的共同预测结果。同时根据PicTar’对miR-30家族成员的排序得分进行分析,认为在该家族中,hsa-miR-30e排序得分更高,相比其他家族成员,更有可能靶向融合基因BCR-ABL。故而本研究选择hsa-miR-30e作为进一步研究对象,探讨其与BCR-ABL融合基因之间是否存在靶向关系。　　 第二部分:hsa-miR-30e基因的克隆及慢病毒表达载体的构建　　 首先提取正常人全血中的基因组DNA；从NCBI中查找到hsa-miR-30e的初始序列,选取包含hsa-miR-30e成熟序列及其两端各约200个碱基的序列,并根据这段序列设计合成引物；以提取的正常基因组DNA为模板,进行PCR扩增miR-30e基因片段；将扩增的miR-30e目的片段与T载体相连构建pMD-18T-miR30e重组质粒,将其转化到感受态E.coli DH5α菌中,并通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆；对阳性克隆进行菌液PCR,抽提质粒后酶切鉴定及测序鉴定,将鉴定正确的阳性克隆扩大培养,提取质粒；对慢病毒载体系统的三套质粒(包括慢病毒质粒pLL3.7、包装质粒pCMV-dR8.91及衣壳蛋白质粒pCMV-VSVG)转化入感受态E.coli STBL3菌中,经酶切鉴定后扩大培养并提取质粒；利用限制性内切酶Xho Ⅰ和Hpa Ⅰ分别对pMD-18T-miR30e重组质粒和慢病毒质粒pLL3.7进行双酶切并进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的片段；利用T4 DNA连接酶对上述两种酶切质粒的回收片段进行连接,构建pLL3.7-miR30e重组质粒,并将连接产物转化感受态E.coli STBL3菌中,抗生素筛选阳性克隆,进行菌液PCR鉴定,并抽提质粒进行双酶切、测序鉴定；将鉴定正确的pLL3.7-miR30e阳性克隆进行扩大培养,连同pCMV-dR8.91和VSVG质粒的转化菌,利用高纯度质粒提取试剂盒提取三种质粒备用。　　 第三部分:pLL3.7-miR30e慢病毒的获取及K562细胞中miR-30e与融合基因BCR-ABL靶向关系的初步鉴定　　 使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养包装细胞293FT细胞,转染前一天在10cm细胞培养皿中铺1×106个293FT细胞:将提取的高纯度质粒pLL3.7-miR30e、dR8.91和VSVG按照质量比为20:15:10的比例混合(总质量为24μg),按质粒DNA混合液与脂质体2000比例为1:2.5的比例取60μl脂质体,并用无血清DMEM培养基制备转染复合物；转染复合物转染293FT细胞48小时后倒置荧光显微镜下观察,并收集慢病毒上清并过滤、分装；梯度稀释慢病毒上清,感染293FT细胞,48小时后倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,并计数表达GFP阳性细胞数,根据公式计算慢病毒上清滴度约为1×106TU/ml。以U6 snRNA作为内参照物,利用购买的miRNA套装引物,应用实时荧光定量RT-PCR相对定量的方法检测感染前后293FT细胞中miR-30e表达情况,实验结果表明感染后293FT细胞中miR-30e表达约为感染前293FT细胞26倍；慢病毒上清感染K562细胞,并应用实时荧光定量RT-PCR和Western-blot方法检测感染前后K562细胞中miR-30e及BCR-ABL融合蛋白的表达情况。　　 综上所述,本研究通过生物信息学软件预测了可能靶向融合基因BCR-ABL的miRNAs,筛选到了miR-30家族,并挑选hsa-miR-30e作为进一步研究对象；正确克隆了表达hsa-miR-30e的基因片段:成功构建了pLL3.7-miR30e重组质粒；并通过包装获取了慢病毒上清,计算其滴度约为1×106 TU/ml；利用所获得的慢病毒上清感染K562细胞,并利用实时荧光定量RT-PCR及Western-blot技术对感染后K562细胞中hsa-miR-30e表达及BCR-ABL融合蛋白表达情况进行了检测。虽然由于所获得的慢病毒上清滴度不高及K562细胞相对难感染性,根据目前实验结果尚不能断定hsa-miR-30e与BCR-ABL融合基因之间是否存在确定性靶向关系,仍需进一步优化实验条件并证明二者之间的靶向关系,但本研究可为进一步在CML中研究靶向融合基因BCR-ABL的miRNAs提供技术和方法支持,有利于扩大研究其它更多的miRNAs在CMl的发生发展中的机制作用,也可为最终的临床干预治疗提供一定参考价值。