抗生素抗性基因在猪粪好氧堆肥和厌氧消化中的变化特征和相关因素分析

来源 :中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hncry
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畜禽养殖使用的抗生素绝大部分都不能被动物体所吸收,而是以原形或代谢物的形式随动物的粪便排出体外,粪便中还含有大量携带抗性基因(ARGs)的耐药菌株,它们给自然环境和人类健康带来巨大威胁。因此,畜禽粪便的无害化处理过程中,抗生素和抗性基因的变化规律,以及其中关键的物理、化学和生物控制因素,值得去深入地研究。  好氧堆肥和厌氧消化是两种主要的畜禽粪便处理工艺。本研究从厦门翔安规模化生猪养殖场采集猪粪,检测其抗生素残留,同时开展好氧堆肥和厌氧消化实验。好氧堆肥过程共设置5个实验组:纯猪粪(M)、猪粪+砖块粉末(MB)、猪粪+砖块粉末+抗生素(MBA)、猪粪+玉米芯(MC)和猪粪+玉米芯+抗生素(MCA)。厌氧消化实验不添加辅料,设置4个实验组:低温消化(25℃)、中温消化(37℃)、中温消化+抗生素(37℃+A)和高温消化(55℃)。实验中既检测了抗生素等理化因子的变化,又用高通量定量PCR同时测定8大类抗性基因(ARGs)和相关可移动元件(MGEs),还对不同工艺阶段的细菌群落结构进行了高通量测序分析,最后探讨了ARGs变化与环境因子和微生物之间的关联。主要实验结果如下:  堆肥结果表明,实验中添加的土霉素(OTC)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)和环丙沙星(CIP)在MBA和MCA中均能有效去除,去除率分别为:80.5-88.7%,93.9-96.9%和80.7-89.5%。但MCA堆体中它们降解速率更快,OTC、SMZ和CIP的半衰期为7.2d,0.6d和2.1d(修正动力学模型结果),远低于MBA。高通量测序结果显示:27个门类的细菌及古菌中,Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Actinobacteria(放线菌门)占主导地位。期间,Firmicutes相对丰度减少了55.15-77.44%,Proteobacteria的相对丰度增加了15.19-32.37%,Bacteroidetes呈现出先下降(2-4d)再上升的趋势(4-35d),Actinobacteria的相对丰度在MC和MCA中显著增加。无论是门水平还是属水平,不同辅料实验组之间,特别是高温期期间,微生物群落结构存在显著差异。高温期结束后,MC和MCA微生物群落丰富度和多样性均比其他处理组低。实验因素中辅料和取样时间对群落有显著影响,理化参数中pH、温度和C/N均有显著影响。堆肥样品中共检出260种ARGs和MGEs,总体而言,辅料对堆肥ARGs丰度和多样性等影响显著。MC和MCA中ARGs相对丰度在高温期显著下降,远低于同期的其他三组。而M、MB和MBA中ARGs相对丰度逐步增加。抗生素对堆肥前期ARGs相对丰度有一定促进作用。受细菌16S rRNA丰度的影响,堆肥中期MC和MCA中ARGs绝对丰度要比MB和MBA高,堆肥结束后大部分都出现回落。堆肥结束后,MC和MCA中ARGs的种类分别减少了34和18种,多样性也较低。根据Fold change结算结果,32种ARGs在整个堆肥过程中均有不同程度的衰减,35种抗性基因在堆肥过程中出现不同程度的富集。通过对ARGs与环境因子和优势微生物门类的RDA分析,得出:M、MB和MBA中ARGs与Proteobacteria、Bacteroidetes正相关,与Firmieutes负相关。堆肥后期,MC和MCA中ARGs的变化与Actinobacteria正相关,说明堆肥中ARGs的变化不仅与温度、pH等环境因素有关,还与微生物活动密切相关。  厌氧消化结果表明,OTC和CIP主要吸附在悬浮颗粒上,而SMZ更多溶解在水中。整个消化系统中,三种抗生素总的去除率的大小顺序为:OTC(69.0%)>SMZ(65.0%)>CIP(37.0%)。高通量测序结果显示:28个门类的细菌及古菌中Firmicutes、Proteobacteria、Euryarchaeota、Bacteroidetes和Acgnobacteria占主导地位。期间Firmicutes的相对丰度略微升高了1.59-6.97%,而Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria稍有下降。55℃条件下,Firmicutes中Ethanoligenens(产氢新菌属)的相对丰度在消化结束后明显增加了0.47-6.41%。α多样性分析结果显示高温条件下微生物群落的多样性最低。实验因素中温度、取样时间和添加抗生素对群落均有显著影响,理化参数中pH和NH4+、NO3-均对群落有显著影响。厌氧消化样品中共检出229种ARGs和MGEs,其中Tetracyclines(四环素类)、Macrolide-Lincosamide-Streptogramin(大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类,MLSB)、Beta_Lactamas(β-内酰胺类)、Multidrug(多重耐药类)以及Aminoglycosides(氨基糖苷类)是ARGs的主要检出类型。厌氧消化结束后,所有处理组中ARGs的数量、相对丰度和绝对丰度以及16S rRNA基因丰度均显著下降,但在55℃条件下降低幅度最小。Fold change计算结果显示:有66种ARGs在厌氧消化过程中出现不同程度的衰减,29种ARGs出现富集。通过分析厌氧消化中各因素对ARGs影响的RDA分析,得出:实验因素中,温度、抗生素和取样时间均对ARGs有显著影响;理化因素中,pH、NH4+、TSS和VSS对ARGs有显著影响;生物因素方面,Streptococcus、Ethanoligenens、Clostridiaceae的SMB53和一个unknown菌属,以及MGEs对ARGs有显著影响。  本研究初步了解了好氧堆肥和厌氧消化的抗生素消除能力,比较全面地展示了猪粪处理工艺中抗生素抗性基因的变化规律及其与工艺条件、理化因素和微生物群落之间的对应关系,为畜禽养殖业控制抗生素抗性基因传播提供一些理论基础和技术支持。
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