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研究背景胞浆羧肽酶1(cytosolic carboxypeptidase 1,CCP1)属于胞浆羧肽酶家族的M14亚族,CCP1常染色体隐性突变会引起pcd小鼠(Purkinje cell degeneration mouse,pcd mouse)出现浦肯野细胞衰退、雄性不育和雌性生殖能力下降。研究发现在正常小鼠脑组织中,CCP1蛋白可以去除α和β-tublin蛋白的多聚谷氨酰胺,但CCP1在小鼠睾丸中的作用仍不清楚;最近研究报道CCP1可通过激活NF-κB信号通路引起浦肯野细胞退化,但该信号通路在雄性生殖系统发育中的作用机制仍不清楚;有研究表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路参与睾丸生精细胞的分化和调亡,但是CCP1的功能缺失是否通过调控该信号通路从而导致pcd小鼠雄性不育未有研究报道。肌球蛋白重链11(myosin heavy polypeptide 11,MYH11)是肌球蛋白(Myosin)家族成员之一,有研究表明Myosin参与了顶体发生,囊泡运输,基因转录和核形成等过程,且肌动蛋白(Actin)和Myosin在精子发生过程中合作促进精子发生;我们前期研究利用LC-MS/MS实验发现MYH11为CCP1在小鼠睾丸中的重要作用蛋白,所以了解CCP1及其相互作用蛋白MYH11在小鼠睾丸中的作用机制,对于揭示其在精子发生和雄性不育中的作用机理具有重要意义。目的通过检测MAPK、NF-κB信号通路中关键蛋白ERK1/2、phospho-ERK1/2(p-ERk1/2)、p38 MAP Kinase(p38)、NF-κB p65(p65)和phospho-NF-κB p65(Ser536)(p-p65)在pcd小鼠不同发育时期睾丸组织中的表达,探究CCP1基因在小鼠精子发生过程中的作用和分子机制;结合生物信息学方法进一步研究CCP1及其相互作用蛋白MYH11在小鼠睾丸中的作用及关系,探究pcd小鼠雄性不育的分子机制。方法第一部分:1.采用Western blot方法分别检测MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白(ERK1/2,p-ERK1/2,p38,p65和p-p65)在pcd小鼠不同发育时期的睾丸和CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中的表达情况。2.采用Western blot方法分别检测pcd小鼠睾丸组织和CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中微管蛋白Tubulin聚谷氨酰胺化水平的表达。第二部分:1.采用免疫组化、RT-PCR和Western blot实验方法检测MYH11在小鼠睾丸和体外培养的三种睾丸相关细胞系中的表达情况。2.采用实时荧光定量PCR(q PCR),Western blot和免疫组化实验方法检测MYH11在pcd小鼠睾丸和CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中的表达情况。3.利用生物信息学方法对MYH11互作蛋白的分子功能、生化过程、细胞组分、信号通路以及相互作用网络进行分析,筛选小鼠睾丸中与MYH11可能发生相互作用的蛋白。4.采用q PCR,Western blot和免疫组化实验方法检测与MYH11可能发生相互作用的肌动蛋白γ2(actin gamma 2,ACTG2)在pcd小鼠睾丸和CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中的表达情况。结果第一部分:1.Western blot实验结果显示相比于野生型小鼠,在出生后15天的pcd小鼠睾丸组织中ERK1/2、p65和p-p65蛋白表达均上调,在出生后18天的pcd小鼠睾丸中ERK1/2、p65和p-p65蛋白表达均下调,而在成年pcd小鼠睾丸中p-ERK1/2、p65和p-p65蛋白表达均上调。在CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中检测结果显示:相比于阴性对照组(CCP1正常表达),在CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中ERK1/2蛋白表达上调,p-ERK1/2和p-p65蛋白表达下调。2.相比于野生型小鼠,在pcd小鼠睾丸组织中微管蛋白Tubulin多聚谷氨酰胺化表达水平升高;相比于阴性对照组(CCP1正常表达),在CCP1敲减的GC-1B型精原细胞中微管蛋白Tubulin多聚谷氨酰胺化表达水平升高。第二部分:1.免疫组化结果显示MYH11在野生型和pcd小鼠睾丸的睾丸间质细胞、支持细胞和生精细胞中均表达,MYH11在三种体外培养的小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)、小鼠睾丸支持细胞(15P-1细胞)和小鼠B型精原细胞(GC-1细胞)中均表达,与MYH11在小鼠睾丸组织中的表达结果一致。2.MYH11在pcd小鼠睾丸组织和CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中表达均下调。3.String数据库分析了置信度大于0.400的前100个与MYH11相互作用的蛋白,结果显示这些蛋白主要与蛋白结合活性和结构分子活性有关,主要参与多细胞生物过程、细胞过程和发育等生物学过程,这些蛋白主要在细胞质和细胞骨架表达,部分位于细胞核、线粒体等细胞器上。信号通路分析结果显示,与MYH11相互作用的蛋白主要参与三个信号通路,即趋化因子和细胞因子介导的炎症信号通路(23个蛋白)、Rho GTP酶调节细胞骨架的信号通路(22个蛋白)和烟碱乙酰胆碱受体信号通路(17个蛋白),值得注意的是,在这三个主要的信号通路中都包含ACTG1、ACTG2、ACTA1、ACTA2、ACTC1和ACTB等肌动蛋白家族成员。结合String和COXPRESdb数据库分析并筛选出在小鼠睾丸中表达且与MYH11相关系数最高(r=0.636)的肌动蛋白ACTG2。4.ACTG2在pcd小鼠睾丸组织和CCP1敲减的GC-1 B型精原细胞中表达均下调,免疫组化结果显示ACTG2在野生型和pcd小鼠睾丸生精细胞、支持细胞和睾丸间质细胞中均表达,与MYH11在pcd小鼠睾丸中的的表达结果一致。结论1.CCP1可能通过调控NF-κB和MAPK信号通路导致pcd小鼠精子发生异常。2.pcd小鼠睾丸组织中存在微管蛋白的聚谷氨酰胺化。3.ACTG2可能是MYH11在小鼠睾丸中的相互作用蛋白。4.CCP1的功能缺失导致MYH11和ACTG2的表达量下调。