心脏肥厚和心脏成纤维细胞中离子通道基因表达水平的研究

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心脏肥厚是心脏为了应对增强的工作负荷而产生的自适应性过程。心脏在适应机械超负荷的过程中会产生心肌细胞的肥大、成纤维细胞的增殖与分化以及多种离子通道和离子转运蛋白表达和活性的改变。早期的心脏肥厚是代偿性的,在增强了心脏负荷的同时也维持了正常的收缩功能。因为心脏的形态发生了变化,所以此过程也被称为重塑;以此类推,细胞和离子通道水平的改变经常被称为细胞和离子通道的重塑。如果过负荷长期持续存在,进一步的心脏重塑最终可导致心脏衰竭。无论是代偿性的心脏肥厚还是心脏衰竭均能增加心律失常和猝死的风险。心脏成纤维细胞是心脏中普遍存在的细胞类型,其不但在正常的心肌功能中发挥重要作用,而且在高血压、心脏肥厚、心肌梗死和心脏衰竭中发生的有害的心肌重塑中也起着关键性的作用。而成纤维细胞的许多功能效应(包括迁移、增殖与分泌性质的增强)都是通过分化成为肌纤维母细胞表型介导的。肌纤维母细胞能够对炎性细胞因子(TNFα、IL-1、IL-6、TGF-β等)、血管活性肽(血管紧张素Ⅱ、内皮素-1、利钠肽等)和激素类(去甲肾上腺素等)产生响应,而以上因子的水平在心脏重塑的过程中均增加。因此,成纤维细胞为心脏肥厚提供了一个潜在的治疗靶点。钾通道是分布最为广泛的离子通道类型,存在于几乎全部的细胞类型中,参与了很多的细胞功能,并且与众多疾病的发生与发展有重要的关系。钾离子通道是递质、激素和药物调节心脏功能的作用靶点。由于正常发育、损伤或疾病所导致的钾离子通道的密度或性质的改变会产生复杂的生理学后果。有研究表明,与心脏肥厚有关的钾通道活动的改变是导致电生理重塑和心律失常的主要因素,而钙依赖的分子通路的改变是钾通道重塑的基础之一。因此,钾通道与钙通道的重塑与心脏肥厚的发生与发展有着重要的关系。但是,目前对于离子通道和心脏肥厚的关系的研究大多集中于心肌细胞,而对成纤维细胞离子通道在心脏肥厚的发生与发展中是否发挥作用尚未知晓,有待进一步研究。本实验利用Real-Time PCR的方法研究钾通道、钙通道、钠通道、氯通道和钠泵在正常成年大鼠和心脏肥厚模型大鼠的心室成纤维细胞中的表达水平,通过与正常成年大鼠心室成纤维细胞的表达水平的比较,研究这些通道和心脏肥厚发生发展的关系。第一部分大鼠心脏肥厚模型的制备以及心脏功能和组织学评价目的:制备异丙肾上腺素(Iso)诱导与腹主动脉缩窄(AAC)诱导的心脏肥厚模型。方法:Iso诱导的心脏肥厚模型:背部皮下注射Iso 5mg/(kg·d),连续七天,即可诱导大鼠心脏肥厚模型;AAC诱导的心脏肥厚模型:成年雄性大鼠常规1.2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,左侧卧位,于侧腹部作一切口,游离出部分腹主动脉,然后用5号缝合线将自制的弯曲的8号针头与腹主动脉一并结扎,再缓缓抽出针头,造成腹主动脉的内径缩窄,最后复位脏器,缝合腹壁。关笼饲养,四周成模。结果:血流动力学:与对照组比较,Iso组LVSP明显下降(P<0.01),LVEDP明显升高(P<0.01),而±dp/dtmax明显下降(P<0.05);AAC组LVSP明显上升(P<0.05),LVEDP明显升高(P<0.01),而±dp/dtmax明显下降(P<0.05)。心脏重量指数(HWI):与对照组比较,Iso组和AAC组心脏重量及HWI明显升高(P<0.01)。病理学检查,HE染色,光镜下可见:对照组大鼠心肌纤维排列整齐,细胞核结构清晰,横纹明显,无细胞肿胀;Iso组和AAC组肌纤维排列紊乱,走向不一,呈旋涡状或簇状互相交错排列,心肌细胞显著肥大。Masson染色,光镜下可见:对照组大鼠心肌纤维排列整齐,无细胞肿胀,无胶原纤维增生;Iso组和AAC组肌纤维排列紊乱,心肌细胞显著肥大,胶原纤维显著增生,并且伴有血管壁纤维化现象。结论:经过AAC处理和Iso处理的大鼠均能成功诱导出心脏肥厚,其中Iso造模方法相对简单,且周期短,成模率高;AAC模型类似临床负荷型心脏肥厚的病理生理学过程,周期较长。两种方法诱导的心脏肥厚模型的成功制备为下一步的实验打下了基础。第二部分心脏肥厚和心脏成纤维细胞中离子通道基因表达水平的研究目的:研究正常成年大鼠与心脏肥厚模型组大鼠心室成纤维细胞中钾离子通道、钙离子通道、钠离子通道以及氯离子通道等的mRNA的表达水平。方法:首先使用酶消化法分别原代分离正常成年大鼠和心脏肥厚模型大鼠的心室成纤维细胞并培养三天,然后按照Trizol法提取总RNA;接着根据Promega Reverse Transcription System中提供的方法合成cDNA的第一链;最后根据Takara SYBR Premix Ex TaqTM荧光试剂盒的说明进行Real-Time PCR反应。数据分析所用的方法为2-ΔCt法,其中Ct值为基因进入指数增长期的循环数,而ΔCt为处理组目的基因的Ct值与对照组目的基因的Ct值之差。结果:1本实验使用β-actin做为内参。在正常组和心脏肥厚组的心室成纤维细胞中,β-actin的表达水平未发生变化(P>0.05),说明β-actin的表达水平相对稳定并不受实验处理的影响。BNP是一种细胞因子,在心脏肥厚时表达水平会升高;而α-SMA在成纤维细胞大量增殖和分化成为肌纤维母细胞时表达水平会升高。本实验的结果显示,与正常大鼠相比,BNP和α-SMA在心脏肥厚模型组的心室成纤维细胞中表达水平均显著升高(P<0.01)。2 Kv2.1、Kv4.1和Kv4.2通道mRNA在心脏肥厚模型的心室成纤维细胞中表达水平均显著升高。Kv1.2通道mRNA在AAC组中表达水平显著降低(P<0.05),而在Iso组中表达水平无明显变化(P>0.05);Kv1.6通道mRNA在Iso组中表达水平显著升高(P<0.05),而在AAC组中表达水平无明显变化(P>0.05)。Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv3.1和Kv4.3通道在各组中的表达水平无明显差异(P>0.05)。3 Kir2.2通道mRNA在心脏肥厚模型的心室成纤维细胞中表达水平显著降低,而Kir6.1通道mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。Kir2.1通道mRNA在AAC组中表达水平显著升高(P<0.05),而在Iso组中表达水平无明显变化(P>0.05)。Kir3.4和Kir6.2通道在各组中的表达水平无明显差异(P>0.05)。4 Nav2.1通道mRNA在心脏肥厚模型的心室成纤维细胞中表达水平显著降低(P<0.01),而Cav3.1通道和Na+-K+-ATPaseβ1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。Nav1.1通道mRNA在AAC组中表达水平显著降低(P<0.05),而在Iso组中表达水平无明显变化(P>0.05);Cav1.2、CLC-3通道和Na+-K+-ATPaseα1 mRNA在Iso组中表达水平显著升高,而在AAC组中表达水平无明显变化(P>0.05)。Na+-K+-ATPaseα2在各组中的表达水平无明显差异(P>0.05)。5在心脏肥厚模型组心室成纤维细胞中表达水平相对于正常水平有较大改变的通道,在正常大鼠心室成纤维细胞中的表达水平也相对较高,如α-SMA、Kv1.6、Kv4.1、Kir6.1和Nav2.1等。结论:在心脏肥厚的发生发展过程中,钾通道、钠通道和钙通道的亚家族的某些亚型可能起到了重要的作用,具体表现在其在心室成纤维细胞的表达水平升高或降低。本实验结果提示钾通道、钠通道和钙通道有作为治疗心脏肥厚药物的作用靶点的潜能。
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