CotA蛋白位于芽孢杆菌芽孢外被的外层蛋白上,具有4个铜离子结合位点,是典型的细菌漆酶,能催化氧化多种底物,具有耐高温,高pH,盐碱的特点。采用大肠杆菌Typel分泌途径分泌表达CotA,不仅避免蛋白形成包涵体,而且有利于蛋白正确折叠及纯化。通过设计引物,PCR扩增连接载体后转化、鉴定,成功得到了 Bacillus amyloliquefaciens LC02 cotA基因,全长1539bp,编码512个氨基酸。经过生物软件分析发现,cotA基因含有三个保守铜离子结合位点,等电点为4.95,编码的蛋白为亲水性蛋白,存在多个跨膜区域。通过双酶切方法构建重组载体cotA-HlyAs/pET-20b(+),h/yBD/pACYC-Duet-1,转化Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组表达菌株Ecoli PCAB。培养条件初步研究后发现,在微好氧(摇床静止)低温的培养条件下,可成功实现E.coli PCAB CotA漆酶的分泌表达。通过优化E.coli PCAB的培养条件,发现重组CotA漆酶的最佳分泌温度为25℃,20 h后蛋白表达量迅速上升,38h蛋白的分泌量趋于稳定。诱导剂IPTG的最佳浓度为1 mM,Cu2+最适浓度为2.2 mM条件下CotA漆酶表达量最高。重组CotA漆酶通过阴离子交换层析DEAE-Sepharose Fast Flow及葡聚糖凝胶层析G75纯化后,经SDS-PAGE电泳发现在65 kDa处显示单一条带。以ABTS为底物,重组CotA漆酶的最适pH为4.0;以SGZ为底物,重组CotA漆酶的最适pH为6.7-7.2时。重组CotA漆酶在碱性条件下能维持很好的活性。以ABTS、SGZ为底物时重组CotA漆酶最适温度分别为60℃、50℃,且蛋白的热稳定性强,高温下仍能保持高的活性。Mg2+对重组CotA漆酶有促进作用,Hg2+对重组CotA漆酶的抑制作用最强;DTT,L-Cys对重组CotA漆酶抑制作用较明显;低浓度的有机溶剂抑制作用较弱,高浓度的抑制作用较强。