糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用所致的代谢性疾病,由于胰岛素分泌缺乏和(或)其生物作用障碍导致的糖代谢紊乱,同时伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等的代谢障碍,以慢性高血糖为主要特征。慢性高血糖常导致眼、肾、神经和心血管等多脏器的长期损害、功能不全或衰竭。业已证实氧化应激是糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一,活性氧(ROS)在糖尿病慢性并发症发病机制中的之一主要是其对组织和细胞的细胞毒性损伤,ROS包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢、一氧化氮(NO)等。NO可迅速和超氧化物结合形成更强的氧化剂——过氧化亚硝酸盐(ONOO-)。ONOO-可通过影响细胞的氧化还原状态和离子通道、使蛋白质发生硝基化或失活,进而限制线粒体呼吸,导致细胞凋亡。　　 近年来研究表明:糖尿病慢性并发症的发生与发展不仅与血糖整体水平升高有关,而且与血糖的波动性也有密切关系,血糖波动性越高,慢性并发症的危险性越大。国外曾进行过一项试验,观察“正常血糖和高血糖交替”对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响,结果发现,“波动性高血糖组”对内皮细胞的损伤比“稳定性高血糖组”更加严重。该项研究提示:波动性高血糖更能增强蛋白激酶C(PKC)活性,激活氧化应激反应,促进内皮细胞凋亡[1],并最终加速动脉粥样硬化的发展。临床研究也正实:波动性高血糖可显著增加2型糖尿病的微血管病变和心血管死亡危险[2]。反复波动的高糖环境下市,由于适应能力欠缺,加速了细胞形态和功能的损害[3]。DCCT和UKPDS试验的大量循证医学研究证实严格控制血糖(即“强化治疗”)可以显著减少糖尿病的并发症,尤其是微血管并发症。同时也必须看到,血糖控制越严格,低血糖事件的发生率越高[4,5],血糖波动的幅度越大,前者的益处在一定程度上被后者所抵消。为此,国际上提出了“精细降糖,平稳达标”这一新的治疗理念,简单的说,就是“既要降低高血糖,又要防止低血糖。”　　 目的：　　 因此,近年来国际上对血糖波动的研究正在逐渐得到重视。目前国际上关于血糖波动的研究多集中于血糖波动对动脉内皮细胞的影响,是体外研究。而且目前的研究主要局限在血糖波动对糖尿病并发症的影响,对于血糖波动对正常机体的影响有何影响;对正常机体胰岛细胞及胰岛素靶细胞敏感性等这些关于糖尿病发生机制的方面研究较少,特别是因为由于急性血糖波动动物模型建立的困难,所以针对急性血糖波动对机体影响的的研究,尚未见报道。本研究拟采用高浓度葡萄糖输注的方法建立活体急性血糖波动大鼠动物模型,以组织病理学、免疫印记技术、RT-PCR等不同的检测方法对血糖波动大鼠肝脏、脂肪、肌肉及胰腺等器官进行检测,探讨体内血糖波动对活体大鼠机体的影响。　　 实验材料及方法：　　 一、实验动物　　 选取7周健康雄性Wistar大鼠30只,体重280g-350g,由中国医科大学实验动物中心提供,清洁度Ⅰ级,随机被分为3组,分别为对照组、血糖波动组、持续高血糖组,常规饲料自由饮水,温度22±1℃,湿度50％左右,明/暗周期为12h。　　 二、建立持续高血糖、波动性高血糖大鼠动物模型　　 大鼠适应实验室环境3-5天后,用10％水合氯醛(按体重0.35mg/kg)腹腔麻醉,将聚乙烯导管2根,分别植入右颈内静脉用于输液和左颈动脉用于采血。大鼠术后恢复5天,进行输液。干预因素:①对照组予0.9％生理盐水,定时检测血糖使血糖维持在5.5±0.5mmol/L左右,在实验第44小时后进行正葡萄糖-高胰岛素钳央实验,将血糖升至20.0±0.5mmol/L,维持半小时;②血糖波动组予50％葡萄糖注射液问断输注,每小时检测血糖一次,使血糖在5±0.5mmol/L与20±0.5mmol/L之间波动,每1小时变动血糖值一次(即血糖控制在5mmol/L持续1小时,然后血糖控制在20mmol/L持续1小时);③持续高血糖组予50％葡萄糖注射液持续输注,每小时检测血糖一次,使血糖维持在20±0.5mmol/L左右。所有实验大鼠输液时间在48小时。输注相应液体48小时后,动物称重,10％水合氯醛按0.3ml/100g腹腔注射麻醉动物,固定于解剖台,剪去胸腹部毛发,迅速开胸腹腔,心内取血5ml,3000转/分离心15分,取上清于-70℃保存备用。摘取肝脏左叶、腋下脂肪及腓肠肌标本,速冻-70℃保存。　　 三、主要实验方法　　 1、血清胰岛素测定:酶联免疫法;　　 2、血清及组织匀浆MDA、SOD测定:比色法;　　 3、血糖测定:采用葡萄糖氧化酶法(BIOSEN5030,德国);　　 4、大鼠肝细胞凋亡、胰腺细胞凋亡测定:应用TUNNEL法;　　 5、大鼠肝脏、肌肉、脂肪TNFα mRNA表达测定:应用RT-PCR法;　　 6、大鼠肝脏、肌肉、脂肪内JNK1、iNOS表达测定:应用免疫组织化学;　　 7、大鼠肝脏、肌肉及脂肪内IRS的表达:Western Blot方法;　　 8、大鼠胰腺组织caspaso-3、Bcl-2、Bax;肝脏内caspas-3的表达测定:应用免疫印迹法。　　 结果：　　 1、各组大鼠体重及空腹血糖:各组大鼠体重(P＞0.05)及空腹血糖(P＞0.05)无统计学差异;　　 2、血糖波动组大鼠血清MDA/SOD比值升高,显著高于持续性高血糖组及对照组(P＜0.01);　　 3、血糖波动组大鼠的葡萄糖输注率及血清胰岛素2h后升高,14h达到高峰后开始下降,46h时仍高于对照组及持续性高血糖组(P＜0.01),48h与持续性高血糖无统计学差异;48h血清胰岛素与胰腺组织MDA/SOD比值呈显著的负相关(P＜0.01):　　 4、46h血糖波动组及持续性高血糖组胰岛素敏感指数显著低于于对照组(P＜0.05),而血糖波动组低于持续性高血糖组(P＜0.05);　　 5、血糖波动组及持续性高血糖组大鼠胰腺组织内MDA/SOD表达明显增加,显著高于对照组(P＜0.01),两者无统计学差异(P＞0.05);血糖波动组大鼠肝脏、脂肪及骨骼肌中MDA/SOD表达明显增加,显著高于对照组及持续性高血糖组(P＜0.05),而且以在胰腺、肝脏组织表达最显著(P＜0.01):　　 6、血糖波动组及持续性高血糖组大鼠胰腺组织内cleavage caspase-3、caspase-3表达明显增加,cleavage caspase-3/caspase比值显著高于对照组(P＜0.01),持续性高血糖组的cleavage caspase-3/caspase比值显著高于血糖波动组(P＜0.05);胰腺组织MDA/SOD比值与cleavage caspase-3/caspase-3比值呈强烈的正相关关系(P＜0.01),血糖波动组及持续性高血糖组胰腺组织B细胞凋亡增加(P＜0.05),但两者之间无差异;　　 7、血糖波动组可见凋亡肝细胞,肝细胞凋亡表达显著高于对照组和持续性高血糖组(P＜0.01);对照组和持续性高血糖组未见凋亡的肝细胞,两组肝细胞凋亡表达在统计学上无显著性差异(P＞0.05);大鼠肝细胞caspase-3:血糖波动组肝细胞内caspase-3及cleavage oaspase-3表达显著高于对照组(P＜0.01)及持续性高血糖组(P＜0.05)。　　 8、血糖波动组大鼠肝脏、脂肪及骨骼肌中JNK1、iNOS表达明显增加,显著高于对照组及持续性高血糖组(P＜0.05),而且以在肝脏组织表达最显著(P＜0.01);MDA/SOD比值与JNK1、iNOS呈显著强烈正相关关系(P＜0.01):　　 9、血糖波动组大鼠肝脏、脂肪TNFα mRNA表达明显增加,显著高于对照组及持续性高血糖组(P＜0.05),而且以在肝脏组织表达最显著(P＜0.01);三组骨骼肌组织中TNFα mRNA表达无统计学差异(P＞0.05);　　 10、血糖波动组大鼠肝脏及脂肪组织中IRS-1的表达显著下降,显著低于对照组及持续性高血糖组(P＜0.05),而三组骨骼肌组织中IRS-1表达无统计学差异(P＞0.05);肝脏组织内IRS-1的表达与SI呈正相关关系(P＜0.01);　　 结论：　　 1、通过输注高浓度葡萄糖注射液,可以建立活体急性波动性高血糖雄性Wistar大鼠动物模型;　　 2、急性波动性高血糖诱导雄性Wistar大鼠体内ROS产生增多,氧化应激水平增强,导致胰岛素分泌水平及胰岛素敏感性下降,机体出现胰岛功能障碍及胰岛素抵抗;　　 3、急性波动性高血糖导致雄性Wistar大鼠胰腺、肝脏、脂肪及骨骼肌组织中ROS产生增加,其中对胰腺及肝脏组织的影响最为严重,并导致caspase-3激活,导致肝细胞及胰岛β细胞凋亡增加;　　 4、急性波动性高血糖诱导大鼠肝细胞内ROS产生显著增加导致肝细胞凋亡显著增加的主要病理生理机制是急性血糖波动导致iNOS表达显著增加,进而导致ROS产生显著增加,后者促进TNFα表达显著增加:TNFα激活INK1细胞信号转导途径,使肝细胞内caspase-3激活,导致急性血糖波动组大鼠体内肝细胞的凋亡显著增加。　　 5、急性波动性高血糖时,大鼠体内肝脏及脂肪组织中IRS-1表达显著较少,可能是急性波动性高血糖导致活体大鼠体内胰岛素敏感性显著降低的主要病理生理机制,其中急性波动性高血糖诱导活体大鼠体内肝细胞凋亡显著增加,使肝脏内IRS-1表达减少,是急性波动性高血糖导致大鼠体内胰岛素敏感性下降的重要病理生理过程。