血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment,VCI）指由脑血管病及其相关危险因素引起的从各种程度认知功能障碍到痴呆的一大类临床综合征,其发病机制复杂,目前尚缺乏明确的治疗药物。血脑屏障的完整性受损是VCI发病的重要病理机制。研究发现血管性痴呆（vascular dementia,VD）或者阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）患者的血脑屏障通透性较同年龄组人群显著增加,而且与AD患者相比,VD患者这一现象更为明显。血脑屏障的屏障作用主要由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothilial cells,BMECs）及其胞间的紧密连接完成,紧密连接使内皮层形成非常完整的屏障界面,通过调控紧密连接来维持血脑屏障的结构和功能完整性无疑是VCI的治疗和药物研发策略之一。但VCI时紧密连接的调控机制不应局限于血脑屏障的框架内,2003年美国科学家Lo EH等提出了“神经血管单元（neurovacular unit）”的概念,强调神经元与脑胶质细胞、微血管内皮细胞及其它成分之间是相互影响、相互联系、动态变化的结构功能单位。将紧密连接,血脑屏障置于神经血管单元的网络中有助于更深入的研究血脑屏障受损与VCI的关系,更重要的是拓展了VCI及其它脑血管病药物的研发策略。丁苯酞（dl-3-n-butylphthalide,dl-NBP）化学名为dl-3-丁基-1（3H）-异苯并呋喃酮,2002年获得中国食品药品监督管理局批准进入临床试验,由于疗效确切于2004年批准正式上市。随后多项临床试验结果显示丁苯酞可以有效改善急性缺血性脑卒中患者神经功能损伤。我们研究团队较早关注到丁苯酞用于VCI治疗的可能性并进行了大量的有益探索,前期的研究数据显示丁苯酞可以改善VCI大鼠和小鼠的认知功能,但尚缺乏丁苯酞对血脑屏障及紧密连接影响机制的研究证据。因此,本研究将基于神经血管单元理论,建立VCI大鼠模型、体外微血管内皮细胞低氧模型及与星形胶质细胞共培养的低氧模型,在整体和细胞水平研究丁苯酞对VCI血脑屏障功能,特别是对紧密连接关键组分的影响及信号调控机制,为丁苯酞应用于VCI的预防和治疗提供理论基础和实验依据。第一部分丁苯酞对血管性认知功能障碍大鼠血脑屏障通透性及紧密连接蛋白的影响目的:观察丁苯酞对VCI大鼠血脑屏障通透性及紧密连接蛋白表达的影响,探讨丁苯酞对VCI大鼠血脑屏障保护的机制。方法:3月龄清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠109只,随机分为5组:假手术组（Sham组）,模型组（Model组）,丁苯酞低剂量治疗组（NBP-L）,丁苯酞中剂量治疗组（NBP-M）和丁苯酞高剂量治疗组（NBP-H）。采用双侧颈总动脉结扎术制备VCI大鼠模型。低、中、高剂量丁苯酞组术后次日分别给予丁苯酞20 mg/kg/d,40 mg/kg/d,80mg/kg/d灌胃,每日1次。连续给药14天后,通过测定脑组织依文思蓝含量评估血脑屏障通透性,应用Western blot检测紧密连接蛋白ZO-1,claudin-5和occludin表达水平,并用透射电镜观察紧密连接超微结构的变化;给药28天后采用Morris水迷宫测定大鼠行为学变化。结果:1.行为学测试结果:定位航行实验显示模型组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长（P<0.05）,NBP-M和NBP-H治疗组的逃逸潜伏期显著短于模型组（P<0.05）;空间探索实验显示,与假手术组相比,模型组在目标象限的停留时间明显减少（P<0.01）,而NBP-M和NBP-H治疗组大鼠较模型组在目标象限停留时间百分比有所升高（P<0.01）。2.依文思蓝血脑屏障通透性检测显示:与假手术组大鼠比较,模型组大鼠脑组织依文思蓝含量明显增高（P<0.01）;NBP-M组和NBP-H组依文思蓝含量较模型组明显下降（P均<0.01）。3.紧密连接蛋白检测结果:Western blot蛋白分析结果显示:模型组claudin-5蛋白表达水平较假手术组明显降低（P<0.01）;与模型组相比,NBP-L组,NBP-M组和NBP-H组claudin-5表达量明显增高,NBP各剂量组claudin-5表达量相比也有统计差异性（P<0.05）;NBP-M组和NBP-H组ZO-1蛋白表达量也均高于模型组（P<0.05）;各组间occludin蛋白表达无统计学差异（F=2.455,P=0.075）。免疫组化结果显示与模型组相比,NBP-H组有更多棕染的claudin-5和ZO-1阳性细胞。4.透射电镜观察结果:模型组紧密连接电子致密带着色较假手术组浅,部分紧密连接处于开放状态;NBP-H组大鼠有较多的电子致密带,超微结构变化介于假手术组和模型组之间。结论:丁苯酞减轻VCI大鼠脑微血管紧密连接超微结构损伤,上调紧密连接蛋白的表达,降低血脑屏障通透性,丁苯酞对VCI大鼠血脑屏障功能的保护与其对紧密连接蛋白的调控相关。第二部分丁苯酞对低氧培养的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白的影响目的:建立体外培养BMECs低氧模型,在细胞水平观察丁苯酞对低氧条件下紧密连接超微结构及关键紧密连接蛋白表达的影响,为进一步机制研究提供细胞学实验依据方法:体外原代培养大鼠BMECs。低氧细胞损伤模型分为四组:1)对照组;2)低氧组:生长至融合的BMECs在三气培养箱(94%N₂,5%CO_2,1%O₂)中培养24 h;3)丁苯酞（0.1μmol/L）组和4)丁苯酞（1.0μmol/L）组:低氧处理前2 h和低氧处理过程中添加相应浓度丁苯酞共孵育细胞。利用transwell建立体外屏障,通过检测辣根过氧化物酶（HRP）浓度评价内皮通透性;透射电镜观察紧密连接超微结构变化;采用免疫荧光细胞化学和Western blot检测紧密连接蛋白表达。结果:1.HRP透过率分析与对照组相比,低氧组HRP透过率显著增高（P<0.01）;丁苯酞（0.1μmol/L）组和丁苯酞（1.0μmol/L）组HRP透过率均较低氧组下降（P<0.05）。2.紧密连接超微结构变化低氧组表现为较低的电子密度结构或细胞间隙;丁苯酞组紧密连接的电子密度稍低,没有明显的断裂和缺失。3.Western blot和免疫荧光细胞染色观察紧密连接蛋白Western blot结果显示,与对照组比较,低氧组细胞claudin-5（P<0.01）和ZO-1蛋白表达下降（P<0.01）;与低氧组比较,0.1μmol/L丁苯酞组（P<0.05）和1.0μmol/L丁苯酞组claudin-5的表达量均显著增高（P<0.01）;同时丁苯酞也显著增加低氧培养BMECs的ZO-1蛋白表达量;各组细胞occludin蛋白表达无差异（F=0.064,P=0.598）。免疫荧光细胞染色显示claudin-5和ZO-1蛋白在对照组细胞的胞膜连续分布,低氧损伤可致上述蛋白荧光强度降低;丁苯酞（1.0μmol/L）共孵育后,claudin-5和ZO-1的荧光强度和线性分布有所恢复。结论:丁苯酞可降低低氧培养下体外内皮屏障的通透性,增强低氧培养的BMECs紧密连接关键蛋白分子的表达水平,本部分实验为丁苯酞通过调控紧密连接蛋白表达改善VCI血脑屏障功能障碍提供了细胞学实验依据。第三部分Akt/GSK-3β/β-catenin通路在丁苯酞增强低氧培养脑微血管内皮细胞紧密连接中的作用目的:在细胞水平观察丁苯酞对低氧培养的BMECs活性氧生成、线粒体损伤,抗氧化酶活性的作用,探讨丁苯酞对紧密连接的保护机制及相关信号通路。方法:本部分实验仍采用原代BMECs,具体分组的干预方法参见第二部分。活性氧的检测将采用DCFH-DA荧光探针法,应用倒置显微镜对原位装载探针的BMECs进行荧光观察,同时应用流式细胞仪对收集细胞后装载探针的样品进行荧光强度分析;采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;采用生物化学方法依照说明书检测抗氧化酶类SOD、GSH-Px活性;Western blot检测细胞Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路蛋白表达。结果:1.丁苯酞减少低氧诱导的活性氧生成低氧培养24 h后BMECs出现较多绿色荧光细胞;0.1μmol/L和1.0μmol/L丁苯酞组DCF绿色荧光强度明显减少,提示丁苯酞可以减少低氧诱导的活性氧生成。流式细胞术分析结果显示,低氧组细胞活性氧的生成明显高于对照组（P<0.01）;0.1μmol/L丁苯酞和1.0μmol/L丁苯酞均可有效减少活性氧的生成（P<0.01）,并且丁苯酞的两剂量组相比较有统计学差异（P<0.01）。2.丁苯酞增加低氧培养的BMECs线粒体膜电位低氧组细胞绿色荧光增多,表明线粒体膜电位降低;丁苯酞孵育后,红色荧光增加,绿色荧光减少,提示0.1μmol/L和1.0μmol/L丁苯酞均可增加线粒体膜电位,减轻线粒体损伤。3.丁苯酞增加BMECs抗氧化酶活性与对照组相比,低氧组细胞SOD活性（P<0.05）和GSH-Px活性均下降（P<0.01）,0.1μmol/L和1.0μmol/L丁苯酞组SOD、GSH-Px活性较低氧组升高（P<0.05）。4.丁苯酞激活低氧培养的BMECs Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路与对照组比较,低氧组细胞p-Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β和β-catenin/β-actin均降低（P<0.01）,表明低氧抑制Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路;与低氧组相比,丁苯酞孵育后p-Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β和β-catenin/β-actin比值均有所增加（P<0.05）。结论:丁苯酞对紧密连接的保护作用与其减少氧化应激损伤、激活Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路相关。第四部分丁苯酞对微血管内皮细胞/星形胶质细胞共培养体系紧密连接claudin-5表达的影响目的:通过建立BMECs和星形胶质细胞共培养体系,观察丁苯酞对低氧损伤下共培养体系BMECs紧密连接蛋白claudin-5表达的影响,探讨星形胶质细胞分泌Sonic hedgehog（Shh）因子在其中的作用。方法:原代培养星形胶质细胞和BMECs,利用transwell建立共培养体系。分为3组:1)对照组;2)缺氧组:transwell小室在三气培养箱(94%N₂,5%CO_2,1%O₂)中培养24 h;3)丁苯酞（1.0μmol/L）组,同时设立3组平行的单独BMECs培养组。Western blot检测BMECs细胞claudin-5和星形胶质细胞Shh蛋白表达;实时荧光定量技术检测Shh基因mRNA表达。同时应用第一部分VCI大鼠脑组织蜡块,常规免疫荧光组织化学检测Shh蛋白表达。结果:1.丁苯酞对共培养BMECs claudin-5表达的影响与BMECs单培养对照组相比,共培养体系的BMECs claudin-5表达量增高;低氧培养24 h后,BMECs单培养和共培养体系claudin-5表达量均显著下降,且两组间比较没有统计学差异（P>0.05）;丁苯酞1.0μmol/L干预后,BMECs单培养和共培养体系claudin-5表达量均较相应的低氧组升高,而且共培养体系的BMECs claudin-5表达量较BMECs单培养组增高,两者有统计学差异（P<0.05）。2.丁苯酞对体外培养星形胶质细胞Shh基因和蛋白表达的影响低氧组与对照组组间Shh因子mRNA和蛋白表达量无统计学差异;丁苯酞可显著提高星形胶质细胞Shh mRNA和蛋白表达水平,与对照组和低氧组比较均有显著差异（P<0.05）。3.丁苯酞对VCI大鼠脑组织Shh蛋白表达的影响假手术组和模型组大鼠脑组织Shh荧光信号较弱;丁苯酞治疗后围绕微血管周围的Shh荧光信号明显增强。结论:丁苯酞可能通过激活星形胶质细胞Shh通路进一步调控内皮细胞紧密连接蛋白,从而改善血脑屏障功能障碍。