石斛(Dendrobium)是我国一种重要的药用观赏植物,目前种质资源匮乏,繁育困难。而WRKY蛋白是植物中特有的一类转录因子家族,其家族成员参与了植物生长、发育以及对逆境胁迫应答的调控并在其中起重要作用。本实验以铁皮石斛(Dendrobium officinale)为材料,克隆得到了一条WRKY(?)基因全长cDNA序列,并运用生物信息学相关软件分析了该序列及其编码蛋白的特性。同时,构建了该基因的植物表达载体并通过农杆菌侵染介导方法转化到烟草基因组中,初步探索并分析了在逆境胁迫下该基因的功能,以期能在分子水平上为石斛繁育提供一些理论依据。主要结果如下：1).本实验根据构建的蝴蝶兰cDNA文库以及其他植物WRKY转录因子基因的保守序列设计引物,利用RACE、RT-PCR等技术从铁皮石斛中克隆了得到了一条长度为1276bp的全长cDNA序列。2).通过生物信息学分析表明,该序列含有930bp的完整开放阅读框,编码310个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域和一个锌指结构,预测蛋白分子量为78.17KD,理论等电点PI为5.03。该蛋白序列与WRKY转录因子家族的一些成员有较高的同源性,属于WRKY类转录因子的第Ⅱ类成员,并命名为DnWRKY29基因。3).构建了pSN1301-DnWRKY29植物表达载体,并通过农杆菌EHA105介导转化烟草并在其中过量表达。通过抗性筛选和PC(?)(?)检测,初步筛选得到了共17株转基因烟草再生阳性植株(To代),经生长发育得到T1代种子,其中选取T0-8,TO-13及TO-15三个株系及其T1代种子进行基因功能分析。4).将野生型和以上三个株系的T1代的种子分别播种在含有200mM氯化钠(NaCl)和200mM甘露醇(Mannitol)的1/2MS胁迫培养基上,观察记录种子的萌发及幼苗的根长和鲜重,发现两者对此胁迫都表现出了敏感,且受NaCl胁迫的影响较大,其中在特定时期内T1种子的发芽率明显低于野生型,Mannitol胁迫条件下的1/2MS上种子的萌发率明显高于NaCl胁迫的1/2培养基上的萌发率；幼苗的根长鲜重结果同上,而在转基因植株间差异不明显,因此推测DnWRKY29基因参与了植物的胁迫应答反应,且初步断定DnWRKY29因子在此过程中是一个负调控子。5).取在1/2Hoagland培养液正常生长4周且大小一致的野生型和转基因型烟草幼苗,转入含有200mM Mannitol的培养液中胁迫24小时。然后称取一定重量的植株苗制成一定比例的匀浆溶液,对其保护酶类如SOD、POD、CAT酶活力及膜脂氧化产物MDA含量进行测定,发现与野生型烟草相比,转基因烟草SOD、POD、CAT活性显著下降,而MDA含量则显著升高。说明在短时间逆境条件下,转基因植株对逆境胁迫更敏感,自由基积累较多,抑制了保护酶的活性和及其清除体内自由基的功能,因而保护酶活性比野生型植株低,而野生型植株耐受性较转基因植株强,清除氧自由基的能力强,所以膜脂氧化产物MDA的含量就会显著降低。