中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3的3-羟基苯甲酸-6-羟化酶表达、纯化及功能研究

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中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3(CCTCC M2011218)在3-5%盐度,pH8-9.5的范围内能够高效彻底降解萘、菲、蒽等多种低分子量多环芳烃(LMW PAHs),具有对PAHs污染高盐碱土壤进行生物强化修复的潜力。本研究分别采用第二代测序Illumina Miseq系统和第三代测序PacBio RSⅡ系统对AD-3菌进行全基因组测序,并结合多种基因识别和蛋白质功能预测的软件和数据库对AD-3菌基因组进行注释分析;选择AD-3菌中被注释为对LMW PAHs降解起重要作用的水杨酸-1-羟化酶(salicylate1-hydroxylase)进行表达、纯化和功能研究。主要结果如下:  (1)中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3的全基因组包含1个染色体和2个质粒,共5,036,008bp。其编码序列覆盖率为88.82%,共预测蛋白编码序列4,537个。AD-3菌中含有很多与降解LMW PAHs相关的基因,其中大部分基因在同一个基因簇上。该基因簇上编码的RHOs2是PAHs代谢通路过程中不可或缺的部分,是降解LMW PAHs反应中的定步酶。结合已报道的耐盐机制,AD-3菌中存在着与K+积累机制、Na+外排机制、相容性溶质的合成及转运机制等耐盐机制的相关基因。除此之外,AD-3菌中含有TypeⅠ型的CRISPR/Cas系统。  (2)研究了中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3中被注释为水杨酸-1-羟化酶的基因功能。该基因长为1,212bp,编码蛋白含有403个氨基酸,在E.coliBL21(DE3)中最佳表达条件为0.2mM IPTG,30℃。经诱导后的E.coliBL21(DE3)不能催化水杨酸,而可以催化3-羟基苯甲酸并生成龙胆酸。从而证明该蛋白为3-羟基苯甲酸-6-羟化酶(3-hydroxybenzoate-6-hydroxylase,3HB6H),而不是注释中的水杨酸-1-羟化酶。  (3)纯化后的3HB6H呈黄色,大小约为46kDa,活性状态下为同源二聚体,辅基为FAD。3HB6H在磷酸盐缓冲液(pH8.0)、37℃、无盐度(NaCl)、无金属离子的条件下长时间内有稳定的活性,酶活为25.2U/mg。除此之外,AD-3菌的3HB6H中Q305、Y306、A308是与FAD结合相关的位点,Y221和Q305是与底物结合相关的位点。  通过对AD-3菌降解LMW PAHs的机理以及耐盐机制作出合理的解释,为AD-3菌在高盐环境中高效降解LMW PAHs的实际应用提供有力的理论指导,为进一步的研究奠定基础。除此之外,修正了基因预测中对AD-3菌中3HB6H的错误注释,解释了AD-3菌降解3-羟基苯甲酸的关键步骤,为AD-3菌降解其他芳香族化合物提供了理论基础。
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