钾(K)是植物生长发育必需的大量矿质营养元素之一,广泛参与植物的各种生理和生化过程,如植物的细胞膨压和渗透压调节、气孔开闭、离子平衡、酶的活化、抵御生物和非生物胁迫等。由于钾在土壤中容易被固定淋失、农作物秸秆的收获带走一部分钾和长期大量的使用氮、磷肥而钾肥施用量不足,造成我国土壤中普遍缺钾,严重限制农业发展。植物吸收钾离子存在高、低亲和两种吸收机制。在高钾环境下,钾离子通道(K Channels)起主要作用,而低钾环境下,钾离子转运蛋白(KTransporters:KT)则发挥主要作用。植物在应对低钾胁迫时,已经进化出包括细胞膜的超极化反应、根系构型变化、增强钾在不同组织中的流动、细胞外酸化和诱导高亲和转运蛋白KUP/HAK/KT (K Uptake Permease /High Affinity K transporter / K Transporters)的表达等形态结构变化和生理生化上的响应机制以提高对钾的吸收和再利用。已有研究结果表明,KUP/HAK/KT是组成水稻中最大的钾离子转运蛋白家族,预测水稻HAK家族有27个成员,在我们的研究开始之际,国际上还没有关于该家族成员在水稻中的表达特征和生理功能的报道。因此,开展对水稻高亲和钾离子转运蛋白生理功能研究,对于揭示水稻在低钾胁迫下的吸收和转运钾素营养的生理、分子机制和培育钾高效利用水稻新品种具有重大意义。本研究以模式作物水稻为研究对象,深入研究水稻高亲和钾转运蛋白基因OsHAK5的生理功能,我们对该基因表达模式的研究、组织和亚细胞定位、异源系统的功能鉴定,以及该基因超表达和敲除材料获得与表型分析等一系列具体的分子和生理试验,获得主要研究结果如下:1、OsHAK5基因的表达模式研究表明,该基因受缺钾诱导上调。启动子融合GUS报告基因结果表明,OsHAK5在根表皮、侧根原基、侧根、中柱细胞、根茎结合部、叶片、花药、胚、种子和种壳都有表达,且在根、根茎结合处和叶片受缺钾诱导,表达增强。亚细胞定位结果显示OsHAK5是一个定位于细胞质膜上的转运蛋白。启动子分割试验结果表明:OsHAK5基因转录起始位点ATG上游-1479到-1776bp范围内可能存在受缺钾诱导的顺式作用元件(cis-element)。OsHAK5表达受不同植物激素的诱导(上调或下调),且在ATG上游-1479到-1776bp范围内有响应生长素信号的顺式作用元件ASF1MOTIFCAMV,外源添加IAA处理,显著增强OsHAK5启动子融合的GUS基因在不同组织的表达活性。2、通过构建酵母表达载体pYES2-OsHAK5,以空载体pYES2作对照,将其分别转入钾离子吸收缺陷型酵母突变菌株R5421和盐敏感型酵母突变菌株AXT3中,以验证OsHAK5在酵母异源体系中的功能,酵母打点试验结果表明:在高钾浓度(20mMK+; 50mMK+)的固体培养上,OsHAK5转化子和空载体生长无明显差异,而在低钾(0.05 mMK+到1mMK+)培养基上,OsHAK5转化子酵母的生长能力显著优于空载体酵母。在高盐浓度的培养基上,OsHAK5转化子酵母比空载体酵母具有更强的耐盐能力,通过对液体培养的酵母进行高盐处理然后进行钾、钠离子含量测定结果表明:OsHAK5转化子酵母比空载体酵母在高盐处理下积累更多的K+而不提高Na+吸收,因此,OsHAK5在酵母中表现为高亲和钾选择性转运体。3、一定时间的低K (0.3 mM K+)和不加K (0 mM K+)水培试验研究表明:OsHAK5超表达材料的生物量、地上部K浓度、K吸收总量和单位时间的K净吸收速率均显著高于野生型材料,有趣的是,根中K浓度反而显著低于野生型材料。OsHAK5突变体材料的生物量、K吸收总量和单位时间钾离子净吸收速率显著降低,而根部的K浓度显著高于野生型材料。正常供钾时,超表达和野生材料生长没有差异,而突变体材料生长受阻的表型不能通过高钾恢复。为了进一步证明OsHAK5参与水稻根系在低K环境中吸收K的生理功能,利用NMT(非损伤原位测定技术)测定了OsH K5超表达、沉默和野生型水稻根尖钾离子吸收流速。在正常供K (1mM K+)时,OsHAK5超表达和沉默材料及其对应的野生型水稻材料根系钾离子吸收流速无明显差异,而低K (0.1 mMK+)处理时,超表达材料钾离子吸收流速较野生型显著提高,而突变体材料显著降低。此外,伤流液试验结果表明,在低K和完全缺K处理时,超表达材料伤流液中的K浓度和K外流速率显著高于野生型,而突变体材料则呈相反趋势。我们的研究结果表明在低钾条件下,OsHAK5不仅有助于水稻对K的吸收,还能增强其地下向地上的转运。4、OsHAK5基因在盐胁迫中的生理功能研究结果表明,在盐胁迫(100mM NaCl)处理下,超表达材料的生物量、K吸收总量和地上部的K+/Na+均显著高于野生型,抗盐胁迫能力增强。与野生型相比,突变体植株地上部的Na+浓度和Na+/K+显著增高,而生物量和K吸收总量显著降低,抗盐能力减弱。这一结果也验证了我们对酵母试验的结论。5、对OsHAK5超表达和敲除水稻植株的表型分析发现,OsHAK5影响了水稻株型具体表现为:与野生型材料相比,超表达材料总分蘖和有效分蘖较野生型显著增加,而突变体材料总分蘖和有效分蘖显著减少,超表达和突变体材料的株高都显著降低。超表达、突变体和野生型材料根尖和根茎结合部生长素含量测定结果表明,OsHAK5超表达和沉默材料的根尖生长素含量只有对应野生型材料的50%,超表达材料根茎结合部生长素含量显著高于野生型,而沉默材料呈相反趋势。OsHAK5的超表达和沉默影响了水稻植株生长素输出载体蛋白PIN家族成员相关基因和输入蛋白AUX1的表达,同时也影响了分蘖数(OsFC1)和分蘖角度(OsLay1;OsTAC)相关基因的表达且超表达材料和沉默材料的表达变化呈现相反的趋势。此外,OsHAK5还影响了[3H]-IAA在水稻植株中的极性运输。不同pH值处理下的根系生长试验结果表明,在pH值为4.5的处理下,超表达根系生长显著优于野生型,而当pH值为5.5和6.5处理下,超表达和野生型根系无明显差异,而沉默材料根系在pH值为4.5、5.5和6.5均表现根系生长受阻现象,尤其在pH4.5处理下根系生长受阻更加严重。推测OsHAK5对水稻株型的改变可能是由于OsHAK5影响了细胞间的pH稳态平衡。综上所述,OsHAK5基因参与了水稻在低钾时对钾素营养的吸收和转运,该转运体呈现为选择性吸收K+,而不吸收Na+。此外,现有的证据显示,OsHAK5可能是通过影响生长素在水稻植株体内的含量和分布,从而实现了对水稻株型的调节。