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目的:神经管畸形（neural tube defects,NTDs）是由于神经管闭合不全导致的一种严重的先天畸形,其危害严重,病因复杂。Micro RNA（miRNA）在神经管发育过程中起着重要作用,其在NTDs发生中的作用尚不清楚,从miRNA的表观遗传角度深入研究NTDs的发病机制意义重大。本研究目的主要有:1从组学水平系统探讨维甲酸（retinoic acid,RA）诱导的NTDs鼠胚神经管组织中miRNA表达谱的变化情况,筛选NTDs发生相关的重要差异表达miRNAs。2研究miR-10a-5p在NTDs和正常鼠胚神经管中的表达差异,以神经干细胞（neural stem cells,NSCs）为细胞模型,探讨其在RA诱导的NTDs发生中的作用及机制。方法:1 NTDs模型的构建和小RNA组测序（small RNA sequence,s RNA-seq）1.1以C57BL/6小鼠为实验动物,于胚胎7.5天（embryonic day 7.5,E7.5）,实验组孕鼠灌胃28 mg/kg RA构建NTDs鼠胚模型,对照组孕鼠灌胃相同剂量香油。1.2于E8.5、E9.5和E10.5三个时间点（神经管闭合期）分别分离对照组和实验组鼠胚脑泡组织,在Illumina Hi Seq TM2000测序平台进行s RNA-seq,获得正常组（Brc8.5、Brc9.5和Brc10.5）和NTDs组（Bra8.5、Bra9.5和Bra10.5）miRNA表达文库。2 NTDs鼠胚miRNA表达谱分析2.1计算对照组和NTDs组文库中miRNA归一化表达的倍数变化（log2 Ratio Bra/Brc）和P值。将符合|log2 Ratio|≥1和错误发生率（false discovery rate,FDR）≤0.001标准的miRNA定义为在两组中显著差异表达的miRNA,获得Bra8.5-vs-Brc8.5、Bra9.5-vs-Brc9.5和Bra10.5-vs-Brc10.5三组文库对的差异表达miRNAs,进一步通过交集分析获得共同差异表达miRNAs。2.2用Targetscan在线数据库预测miRNA作用的候选靶基因,并对候选靶基因进行GO和KEGG pathway显著性富集分析,了解候选靶基因参与的生物学过程及信号代谢通路。2.3筛选部分NTDs相关的差异表达miRNAs进行RT-q PCR表达量验证。3基于sRNA-seq数据分析,选取miR-10a-5p这一在NTDs鼠胚中表达丰度最高、差异倍数最大的上调差异表达miRNA为本部分研究的靶点,研究其表达异常对神经细胞生物学功能的影响。3.1采用RT-qPCR技术对miR-10a-5p在NTDs鼠胚中的时空表达模式进行检测。3.2分别使用miR-10a-5p过表达慢病毒（LV-miR-10a）和miR-10a-5p mimics（mim-10a）转染NSCs和小鼠脑神经瘤细胞系Neuro-2a（N2a）,并采用RT-q PCR检测miR-10a-5p的表达情况。3.3采用Brd U法和CCK-8法检测miR-10a-5p过表达对细胞增殖的影响;采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测miR-10a-5p过表达对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用细胞免疫荧光技术检测miR-10a-5p对NSCs向星形胶质细胞（GFAP阳性细胞）和神经元（MAP2阳性细胞）分化的影响。4 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究4.1采用生物信息学预测miR-10a-5p作用的靶基因,筛选在神经系统中高表达且具有重要功能的Chl1为其候选靶基因。4.2采用双荧光素酶报告实验验证Chl1为miR-10a-5p的靶基因。4.3采用RT-q PCR和Western Blot（WB）检测RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1m RNA和蛋白的表达,采用免疫荧光技术检测胚胎脑部切片中CHL1的表达。4.4在NSCs中转染LV-miR-10a,采用RT-q PCR和WB检测靶基因Chl1的m RNA和蛋白的表达。4.5使用CHL1 si RNA转染NSCs,采用RT-q PCR和WB检测CHL1的m RNA和蛋白的表达情况。采用Brd U法检测CHL1敲低对细胞增殖的影响;采用FCM检测CHL1敲低对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用细胞免疫荧光技术检测CHL1敲低对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。4.6使用CHL1过表达腺病毒（AV-CHL1）和LV-miR-10a共转染NSCs进行回补实验,采用WB检测CHL1的表达情况。采用Brd U法检测CHL1回复表达对细胞增殖的影响;采用细胞免疫荧光技术检测CHL1回复表达对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。4.7采用WB检测RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1下游MAPK通路蛋白的表达。采用免疫组化技术检测切片中Ki67的表达;采用组织原位细胞凋亡检测技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL）检测切片中细胞的凋亡情况。4.8使用CHL1 si RNA转染NSCs,采用WB检测靶基因下游ERK/MAPK信号通路蛋白的表达情况。4.9用ERK激动剂Honokiol进行回补实验,LV-miR-10a转染NSCs后加入Honokiol,采用Brd U法检测对细胞增殖的影响;采用细胞免疫荧光技术检测对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。结果:1 NTDs模型的构建和s RNA-seq1.1在E8.5时,与对照组相比,NTDs组鼠胚神经褶皱形态异常,闭合延迟;在E9.5和E10.5时,NTDs组鼠胚脑部均可观察到发育畸形,神经管未闭合。说明使用本实验方法能够成功构建小鼠NTDs模型,其较好地模拟了无脑畸形这一临床NTDs表型。1.2对提取的RNA、c DNA文库和测序数据进行质控,表明其质量较高,能够用于后续生物信息学分析。2 NTDs鼠胚miRNA表达谱分析2.1 Bra8.5-vs-Brc8.5检测到241个差异表达miRNAs,上调11个,下调230个;Bra9.5-vs-Brc9.5检测到271个差异表达miRNAs,上调47个,下调224个;Bra10.5-vs-Brc10.5检测到213个差异表达miRNAs,上调46个,下调167个。2.2使用Targetscan预测差异表达miRNA的候选靶基因。将s RNA-seq与课题组前期在相同样本上进行的转录组测序（m RNA-seq）数据联合分析过滤靶基因,过滤后的差异表达miRNAs和靶基因结果:在Bra8.5-vs-Brc8.5中有232对miRNA-m RNA,包含147个基因和62个miRNAs;在Bra9.5-vs-Brc9.5中有1223对,包含779个基因和115个miRNAs;在Bra10.5-vs-Brc10.5中有1530对,包含853个基因和84个miRNAs。2.3对过滤后的miRNAs的靶基因进行GO功能性富集分析,我们发现各时期的靶基因涉及的生物学过程主要包括neuron fate commitment、neuron differentiation、central nervous system development、neurogenesis、nervous system development等。分析了在GO term“central nervous system development”中富集的所有靶基因及相应的miRNA-m RNA对,筛选了19个miRNA-m RNA负调控对。2.4对过滤后的miRNAs的靶基因进行KEGG pathway富集分析,我们发现这些基因主要参与ECM-receptor interaction、pathways in cancer、neuroactive ligand-receptor interaction等pathway。2.5通过对Bra8.5-vs-Brc8.5、Bra9.5-vs-Brc9.5和Bra10.5-vs-Brc10.5三组文库对进行交集分析,我们筛选到了41个共同差异表达miRNAs。分层聚类分析将miRNAs亚群分为5类。对其中5个miRNAs进行了RT-q PCR验证,其表达模式均与测序结果一致。2.6对41个共同差异表达的miRNAs和196个共同差异表达的m RNAs进行联合分析,我们筛选了8个miRNA-m RNA对,它们在3个时间点上的表达模式均呈负相关。2.7 miR-10a-5p是在NTDs鼠胚中表达丰度最高、差异倍数最大的上调差异表达miRNA,其可能与NTDs发生密切相关。3 miR-10a-5p异常表达对神经细胞生物学功能的影响3.1 RT-q PCR结果显示:miR-10a-5p在NTDs鼠胚中的表达显著高于对照组。3.2 RT-q PCR结果表明,LV-miR-10a和mim-10a分别转染NSCs和N2a后,miR-10a-5p的表达水平显著升高。3.3 Brd U和CCK-8结果显示:miR-10a-5p过表达抑制细胞的增殖能力;FCM结果表明:miR-10a-5p过表达使细胞周期阻滞,细胞被捕获在了G1期,无法进入S期;FCM结果表明:miR-10a-5p过表达诱导细胞的凋亡;免疫荧光结果表明:miR-10a-5p过表达时NSCs向星形胶质细胞分化的能力显著低于对照组。4 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究4.1生物信息学筛选miR-10a-5p的候选靶基因。4.2双荧光素酶报告实验证实:Chl1为miR-10a-5p的靶基因。4.3 WB结果显示:在RA诱导的NTDs鼠胚组织样本中CHL1蛋白表达水平降低;免疫荧光结果显示:NTDs组织样本中CHL1表达降低。4.4 NSCs中miR-10a-5p过表达后,CHL1的m RNA和蛋白水平均降低。4.5转染CHL1 si RNA可降低NSCs中CHL1 m RNA和蛋白的表达水平。Brd U结果显示:CHL1敲低抑制细胞的增殖能力;FCM结果表明:CHL1敲低使细胞周期阻滞,细胞被捕获在了G1期,无法进入S期;FCM结果表明:CHL1敲低诱导细胞的凋亡;免疫荧光结果表明:CHL1敲低时NSCs向星形胶质细胞分化的能力显著低于对照组。4.6 WB结果显示:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对CHL1表达的抑制作用;Brd U结果显示:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对细胞增殖的抑制作用;免疫荧光实验结果表明:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对细胞分化的影响。4.7 WB结果显示:在RA诱导的NTDs鼠胚组织样本中MAPK通路的蛋白的磷酸化水平降低;免疫组化结果显示:NTDs组织样本中Ki67表达降低;TUNEL结果显示:NTDs组织样本中细胞凋亡增加。4.8 CHL1 si RNA转染NSCs使其在细胞中低表达后,WB结果显示:CHL1下游ERK/MAPK信号通路的蛋白表达水平降低。4.9 WB结果显示:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对p-ERK表达的抑制作用;Brd U结果显示:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对细胞增殖的抑制作用;免疫荧光实验结果表明:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对细胞分化的影响。结论:1通过对NTDs鼠胚的miRNA表达谱进行差异表达分析、功能富集分析筛选出NTDs相关miRNAs,并分析了预测靶基因参与的生物学功能,应用RT-q PCR对部分miRNAs的表达进行了验证;筛选出miR-10a-5p在RA诱导的NTDs胚胎中异常高表达,其可能与NTDs的发生发展密切相关。2 miR-10a-5p在RA诱导的NTDs中发挥致畸作用,其通过靶向调节CHL1表达抑制下游MAPK信号通路,使细胞增殖、凋亡和分化失调,影响神经管发育。