结节性硬化症(Tuberous Sclerosis Complex,TSC)是一种由于TSC-1或TSC-2基因突变引起的全身多系统受累的常染色体显性遗传的综合症,机体TSC-1和TSC-2基因突变,导致其分别编码肿瘤抑制因子错构素蛋白(hamartin)和马铃薯球蛋白(tuberin)表达异常,激活下游雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,m TORC1)通路,伴随细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、雌激素受体α(estrogen receptorα,ER-α)、磷脂酰肌醇3-激酶(phospho inositide3-kinase,PI3K)和磷酸化S6核糖体蛋白激酶(Phospho-S6 Ribosomal Protein,P-S6)等多种信号通路的异常,从而导致细胞增殖生长、分化、自噬、凋亡等失控。由于其累及组织和器官广泛,症状也复杂多样,临床可表现为肺、心脏、脑、肾脏、皮肤面部、视网膜等多器官的“良性”肿瘤,最终造成多器官功能衰竭而导致死亡,严重危害人类健康。肺淋巴血管平滑肌瘤(lymphangioleiomyomatosis,LAM)是TSC在肺部的主要并发症,多见于育龄期或绝经前女性。临床症状缺乏特异性,主要表现为进行性的呼吸困难、咳血、自发性气胸和乳糜胸等。由于LAM早期症状不典型,临床确诊有赖于肺穿刺组织病理学检查,典型的病理特征为异常增殖的平滑肌细胞侵润肺组织,累及淋巴管、血管和气管,可阻塞气道和淋巴管,引起淋巴管异常扩张和肺囊性变,晚期形成结节、肺泡广泛囊性扩张,导致呼吸衰竭。鉴于LAM常见于育龄期女性,推测雌激素可能促进了LAM的发生发展,临床治疗采取卵巢切除,服用雌激素受体拮抗剂等,取得较好临床疗效,但个体差异较大。研究表明LAM发病机制关键在于TSC2基因缺失致m TORC1通路异常激活,靶向m TORC1通路抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)已于2015年5月被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于LAM的治疗,可显著改善LAM患者的肺功能。但在后续的临床试验随访中却发现停用雷帕霉素治疗后,LAM患者的肺功能又继续恶化。因而,继续深入探究LAM发生发展的机制,探索更有效的治疗具有重要的临床意义。目前,LAM细胞的确切起源尚不清楚,对散发和复发的LAM患者进行的遗传学分析提示LAM细胞可能通过潜在的转移途径迁移到靶器官,临床上LAM患者进行肺移植术后仍能复发,越来越多的循证医学证据都表明LAM可能是一种转移性肿瘤疾病。胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2)属于IGFBP超家族,其与胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ和-Ⅱ)有很高的亲和力,还参与整合素、VEGF、NF-κB、ERK1/2等通路的激活,与肿瘤细胞的增殖转移,诱导肿瘤血管形成,肿瘤凋亡,雌激素的调节都有密切联系,已经作为乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胶质瘤、肺癌、前列腺癌和胃癌等肿瘤疗效和预后的标志物之一,有望成为最有潜力的肿瘤治疗的候选靶点之一。我们前期研究发现相对于正常肺组织,IGFBP2和ER-α在人LAM组织中高表达,雌二醇(estradiol,E2)促进了LAM的生长和转移,提示E2/ER-α可能通过调控IGFBP2促进LAM发生发展。本研究旨在探究LAM的发生转移机制,探究E2/ER-α是否调控IGFBP2促进LAM发生发展及其可能的调控机制,筛选并鉴定潜在的有效治疗靶点,为提高LAM的临床疗效提供新的策略。在前期研究基础上,拟进一步探究LAM组织中IGFBP2表达水平及其与临床参数和预后的相关性,并分析其与ER-α表达的相关性,初步探究IGFBP2介导E2/ER-α促进LAM生长转移及其作用机制。研究证实LAM发病机制关键在于TSC2基因缺失,前期成功构建人LAM原代细胞(621-101 TSC2-和621-103 TSC2+细胞),进一步体外实验研究,以人LAM细胞(621-101 TSC2–ER-α-)为研究对象,通过转染ER-α表达载体,上调ER-α基因表达,探究E2/ER-α调控LAM细胞中IGFBP2的表达以及可能的机制;沉默IGFBP2基因表达,评价IGFBP2对人LAM621-101细胞生长增殖,存活,侵袭和转移等生物学功能的影响。同时,以ELT3细胞(TSC2-),替代人LAM细胞621-101(难以形成移植瘤)构建CB17-SCID小鼠移植瘤模型,体内试验进一步探究E2/ER-α调控IGFBP2促进移植瘤的生长。第一部分正常肺组织和LAM组织中IGFBP2和ER-α的表达及临床病理学意义方法1.Western blot和Real time-PCR联合检测21例正常肺组织和21例LAM组织中IGFBP2蛋白和m RNA的表达、以及P-S6蛋白的表达。2.组织免疫荧光法检测LAM组织中IGFBP2和P-S6的细胞定位表达。3.免疫组织化学法检测LAM组织中IGFBP2、α-actin、ER-α和P-S6的表达。4.根据免疫组化结果,分析ER-α表达和IGFBP2蛋白表达相关性及其与LAM临床病理参数的关系。5.统计学处理:所有数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据的相关分析和统计,两分类变量的差异比较采用Pearson’sχ~2检验;两有序变量之间的相关性检验采用Spearman等级相关分析,采用t检验统计确定两组均数之间的差异,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.Western blot和Real time-PCR联合检测结果显示:LAM组织中与正常肺组织中IGFBP2的蛋白和m RNA相对表达增加2倍以上的比率分别为71.43%、14.29%、76.19%和19.05%,LAM组织中P-S6蛋白表达显著高于正常肺组织;组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2.组织免疫荧光结果显示:LAM组织中IGFBP2蛋白表达主要定位于细胞核,P-S6蛋白表达主要定位于细胞膜和细胞浆。3.免疫组织化学检测结果显示:LAM组织中α-actin和P-S6蛋白阳性率100%,进一步辅助LAM的组织病理学诊断。ER-α蛋白和IGFBP2蛋白主要是细胞核表达,ER-α在LAM组织中表达阳性率显著增加,IGFBP2在正常肺组织、ER-α阴性LAM组织和ER-α阳性LAM中阳性表达率分别为4.76%、33.33%和88.89%,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.根据免疫组化结果,在LAM组织中IGFBP2蛋白表达与患者年龄、病灶大小比较均未见相关性(P>0.05),与肺功能下降相关(P<0.05),提示IGFBP2可能是LAM患者预后相关的生物标志物;Spearman等级相关分析结果表明ER-α的表达和IGFBP2的表达呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)。小结1.人LAM组织中IGFBP2蛋白和m RNA表达显著高于正常肺组织,蛋白主要定位于胞核表达,其高表达与LAM患者肺功能下降相关,可能是预测LAM临床不良预后的一个潜在生物标志物。2.人LAM组织中IGFBP2表达与ER-α阳性表达正相关,提示IGFBP2可能参与E2/ER-α促进LAM的发生发展和转移。第二部分E2/ER-α调控人LAM细胞621-101中IGFBP2的表达方法1.Western blot检测人LAM细胞621-101(TSC2-)和621-103(TSC2+)中IGFPP2的表达2.在人LAM细胞621-101(TSC2-)中,转染p EGFP-C1-ER-α表达载体,Western blot检测转染效率;3.Western blot分别检测对照组、转染ER-α组、转染ER-α联合E2(刺激24h)组细胞IGFBP2蛋白表达水平的变化。4.细胞免疫荧光法分别检测对照组、转染ER-α组、转染ER-α联合E2(刺激24h)组细胞IGFBP2蛋白在细胞内表达分布的情况。5.统计学处理:所有数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据的分析和统计,两分类变量的差异比较采用Pearson’sχ~2检验;采用t检验统计确定两组均数之间的差异,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.Western blot结果显示:与621-103细胞(TSC2+))相比,IGFBP2在621-101(TSC2-)细胞中蛋白表达显著增加。2.Western blot结果显示:与对照组相比,转染ER-α组,ER-α蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),成功构建621-101 ER-α+细胞,为后续研究提供靶细胞。3.Western bolt结果显示:对照组、转染ER-α组、转染ER-α联合E2组,三组IGFBP2蛋白表达没有统计学差异(P>0.05)。4.细胞免疫荧光结果显示,对照组与转染ER-α组,IGFBP2表达定位主要位于细胞膜和细胞浆,转染ER-α联合E2组,IGFBP2表达定位主要分布于细胞核,表明E2/ER-α促进IGFBP2核表达。5.Western bolt结果显示:与对照组和转染ER-α组相比、转染ER-α联合E2组细胞中IGFBP2细胞核表达较高,差异有统计学差异(P<0.05)。小结1.人LAM细胞中IGFBP2高表达,提示在LAM细胞中,TSC2可能参与IGFBP2的调控。2.成功构建人LAM 621-101 TSC2-ER-α+细胞,E2刺激24h,能促进621-101TSC2-ER-α+细胞中IGFBP2的核表达,提示E2/ER-α通路可能调控IGFBP2的核表达促进LAM的发生发展。第三部分siRNA沉默IGFBP2表达对人LAM 621-101细胞生物学功能的影响方法1.si RNA IGFBP2转染621-101细胞,Western blot和Real time PCR检测转染效率。2.沉默IGFBP2表达,MTT法检测细胞增殖。3.沉默IGFBP2表达,PI拒染法检测细胞存活率。4.沉默IGFBP2表达,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。5.沉默IGFBP2表达,Western blot法检测p-ERK1/2的蛋白表达影响。6.mTOR通路抑制剂雷帕霉素和ERK1/2通路抑制剂AZD6244单药或联合处理621-101细胞,Western blot检测对p-ERK1/2、IGFBP2和P-S6蛋白表达。7.统计学处理:所有数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据的分析和统计,两分类变量的差异比较采用Pearson’sχ~2检验;采用t检验统计确定两组均数之间的差异,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.与对照组相比,si RNA转染组IGFBP2蛋白和m RNA表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.与对照组相比,E2能促进621-101细胞的增殖,沉默IGFBP2表达能抑制E2的促增殖作用(P<0.05)。3.与对照组相比,E2能减少621-101细胞的死亡,沉默IGFBP2表达能抑制E2的促存活作用(P<0.05)。4.与对照组相比,siRNA IGFBP2组细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.05)。5.与对照组相比,siRNA IGFBP2能抑制p-ERK1/2表达。6.雷帕霉素能降低P-S6蛋白表达;AZD6244降低p-ERK1/2蛋白表达,增加P-S6表达;雷帕霉素和AZD6244单药或联合均不影响IGFBP2的蛋白表达。小结1.E2能促进621-101细胞的增殖和降低细胞死亡,沉默IGFBP2表达能抑制E2的促增殖和促存活作用、抑制621-101细胞的侵袭和转移。体外实验结果提示IGFBP2可能介导E2/ER-α促LAM的生长和转移。2.沉默IGFBP2表达可以降低p-ERK1/2的表达,表明IGFBP2参与LAM的发生发展,可能与激活p-ERK1/2通路有关。3.m TOR通路抑制剂雷帕霉素和ERK1/2通路抑制剂AZD6244单药或联合处理均不能抑制IGFBP2的表达,沉默IGFBP2的表达可以降低p-ERK1/2的表达,提示p-ERK1/2可能是IGFBP2的下游靶点。第四部分体内实验验证E2/ER-α调控IGFBP2促进ELT3 TSC2-细胞移植瘤的生长方法1.建立ELT3 TSC2-细胞来源的CB17-SCID小鼠移植瘤模型,比较E2治疗组和安慰剂组移植瘤体生长的差异。2.免疫组织化学法检测E2治疗组和安慰剂组移植瘤中IGFBP2、α-actin蛋白的表达。3.组织免疫荧光法检测E2治疗组和安慰剂组移植瘤中IGFBP2蛋白和P-S6蛋白表达定位的变化。4.Western blot法检测E2治疗组和安慰剂组细胞核和细胞浆中IGFBP2的表达。5.统计学处理:所有数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据的分析和统计,两分类变量的差异比较采用Pearson’sχ~2检验;采用t检验统计确定两组均数之间的差异,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.与安慰剂组相比,E2治疗组移植瘤生长明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.免疫组织化学法检测结果显示:E2治疗组和安慰剂组中IGFBP2蛋白阳性率分别为80%和20%,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。3.组织免疫荧光检测结果显示:安慰剂组和E2治疗组细胞中P-S6主要是胞浆和胞膜表达,表达分布没有差异。与安慰剂组相比,E2治疗组IGFBP2蛋白胞核表达显著增多,E2显著促进IGFBP2的核表达。4.Western blot法检测结果显示:与安慰剂组相比,E2治疗组细胞核中IGFBP2表达较高,细胞浆中表达较低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。小结1.体内实验表明,E2能增加ELT3细胞移植瘤IGFBP2基因的蛋白表达,促进移植瘤的生长。2.体内实验表明,E2/ER-α能促进IGFBP2的核表达,IGFBP2可能是E2/ER-α的效应基因,介导E2/ER-α促进LAM的发生发展。结论1.前期研究表明E2能促进LAM的生长和转移,本研究发现,与正常肺组织相比,LAM组织中IGFBP2蛋白和m RNA高表达,IGFBP2蛋白胞核表达与ER-α表达正相关,提示IGFBP2可能参与E2/ER-α促进LAM的发生发展和转移,且IGFBP2高表达与LAM肺功能下降密切相关,可能是LAM一个潜在的预后评价指标。2.成功构建621-101 TSC2-ER-α+细胞,证实E2/ER-α能促进IGFBP2的核表达,提示E2/ER-α可能调控IGFBP2细胞核表达促进LAM的发生发展。3.E2能促进621-101细胞的增殖和减少细胞死亡,沉默IGFBP2表达能阻断E2的促细胞增殖和减少细胞死亡作用、并能抑制621-101细胞的侵袭和转移。提示IGFBP2可能介导E2/ER-α促LAM的生长和转移,机制可能与激活下游p-ERK1/2通路有关。4.体内实验表明,E2能增加ELT3细胞来源的移植瘤中IGFBP2蛋白细胞核表达,促进移植瘤的生长。提示IGFBP2可能是E2/ER-α的效应基因,介导E2/ER-α促进LAM的发生发展。