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本研究选择LMP7基因第六内含子中的3个SNPs位点,即3911G/T(37360)3912C/T(rs2071464)、4069C/T(rs55745125),调查其在辽宁汉族和广西壮族群体中的等位基因和基因型频率分布,为人类遗传学、法医学和临床医学等学科提供有价值的参考数据。
材料与方法:
1、225例辽宁汉族健康人静脉抗凝血和11例已知亲缘关系家系静脉抗凝血;177例广西壮族健康无关个体静脉抗凝血。
2、应用PCR-RFLP技术调查辽宁汉族和广西壮族中LMP7基因3个SNPs位点的多态性分布,并应用于亲子鉴定案例。
3、直接计数法计算LMP7基因3个SNPs位点的等位基因频率和基因型频率;进行Hardy-Weinberg平衡检验检测所研究的群体是否具有代表性;应用SPSS13.0软件进行X2检验比较不同人群间等位基因频率分布差异是否具有显著性;计算法医学参数:杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、个人识别率(DP)和非父排除概率(EPP)。
结果:
1、在辽宁汉族和广西壮族中,LMP7基因3911位点均未检出多态性,3912位点均检出C、T两个等位基因和CC、CT、TT三种基因型,4069位点检出C、T两个等位基因和CC、CT、TT三种基因型。
2、在辽宁汉族中,3912位点C和T等位基因频率分别为0.6044、0.3956,CC、CT、TT基因型频率分别为0.3733、0.4622、0.1645;4069位点C和T等位基因频率分别为0.9444、0.0556,CC、CT、TT基因型频率分别为0.8933、0.1022、0.0045。
在广西壮族中,3912位点C和T等位基因频率分别为0.4124、0.5876,CC、CT、TT基因型频率分别为0.1469、0.5311、0.3220;4069位点C和T等位基因频率分别为0.8616、0.1384,CC、CT、TT基因型频率分别为0.7458、0.2316、0.0226。
3、三个SNPs位点共同组成四种不同的等位基因类型A*、B、C和D。四种等位基因的基因频率辽宁汉族和广西壮族中分别为0.3762、0.5665、0.0252、0.0321和0.5508、0.2985、0.0615、0.0892,两个人群中检出A*A*、A*B、BB、BC、CC、DX*六种基因型,基因型频率分别为0.1644、0.4000、0.3289、0.0400、0.0044和0.3220、0.3672、0.0565、0.0678、0.0226、0.1638。
4、3912C/T和4069C/T位点的H、PIC、DP、PE值在辽宁汉族中分别为0.3172、0.2779、0.4997、0.1390和0.3353、0.2707、0.4893、0.1353;广西壮族中分别为0.3983、0.3365、0.5884、0.1680和0.1938、0.1984、0.3608、0.0992。三个SNPs位点组合等位基因的H、PIC、DP、PE在汉、壮两个群体分别为0.4978、0.4435、0.6993、0.2875和0.4011、0.5324、0.7263、0.4109。
用于实际案例分析,在所检测的11个2代3口家系中,未否定生物学父子关系。
讨论:
对辽宁汉族和广西壮族两个群体进行Hardy-Weinberg平衡检验的结果表明,LMP7基因3912C/T和4069C/T位点基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(p>0.05),说明本研究抽样调查具有群体代表性。
序列分析表明,3911位点与韩国人和日本人的研究报告不同,在我国两个人群中均未检出多态性。3912和4069位点检出多态性,与国外报道一致。调查结果统计,3912位点最常见的等位基因在辽宁汉族中为C,广西壮族中为T,4069位点在两个人群中最常见的等位基因为C。对于LMP7基因三个SNPs位点组合,本研究在两个人群中均检出A*(3911G-3912T-4069C)、B(3911G-3912C-4069C)、C(3911G-3912C-4069T)和D(3911G-3912T-4069T)四个等位基因。本研究检出的等位基因A*与韩国、日本人报告的等位基因A(3911T-3912C-4069C)有所不同,表现在3911和3912位点上的碱基差异。但无论是A*还是A,在3911和3912这两个位点的碱基顺序均不能被限制性内切酶HhaⅠ识别,因此基因型A*A*和AA的限制性内切酶酶切结果相同;等位基因B、C和D核酸序列与其他人群中比较未见差异。
本研究采用PCR-RFLP方法检测到基因型A*A*、A*B、BB、BC、CC和DX*,其中DX*酶切后检出五条片段,与kim等报道的产生六条片段的基因型DX有所不同。因此称为DX*。序列分析发现基因型DX*为3911GG-3912CT-4069CT,结合酶切结果考虑基因型DX*中可能包含A*、B、C和D四种等位基因,其中X为A*、B和C三种等位基因中的某一个。此外,基因型A*C的碱基序列同为3911GG-3912CT-4069CT。因此,DX*中很可能也包含基因型A*C。若要确定究竟为何种型别,需要进行家系研究才能判定。这说明当3912和4069位点均为杂合子时,用PCR-RFLP方法检测有其局限性。
本研究中3912C/T和4069C/T位点基因分布在两个人群间具有显著性差异(p<0.05)。与其他人群资料比较,3912C/T位点基因,在辽宁汉族和广西壮族的分布与韩国人、日本人具有显著性差异;在4069C/T位点,辽宁汉族与韩国人、日本人之间无显著性差异,而广西壮族与这些人群均具有显著性差异。Faucz等在巴西美印第安人和巴西白人中未发现3912和4069位点存在多态性。这一结果表明,LMP7基因3912C/T和4069C/T位点基因分布在不同的人群间具有遗传差异。
根据3912C/T和4069C/T两个位点和两个位点组合的等位基因频率调查结果,计算出各位点和两个位点组合时的杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、个人识别率(DP)和非父排除率(PE)及位点组合的法医学参数。结果表明,3912C/T位点在辽宁汉族和广西壮族中分别属于中等和高等鉴别能力的遗传标记,4069C/T位点在两个群体中均属于中等鉴别能力的遗传标记,两个位点组合时在两个人群中均属于高鉴别能力的遗传标记。两个SNPs位点在法医学个人识别与亲子鉴定中具有实际应用价值,SNPs位点组合较单个SNP位点具有更高的法医学应用价值。
结论:
1、LMP7基因3911G/T位点在辽宁汉族和广西壮族中未检出多态性。
2、3912C/T和4069C/T两个SNPs位点在两个人群中具有遗传多态性,基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。
3、LMP7基因三个SNPs位点等位基因分布具有种群差异。
4、LMP7基因三个SNPs位点组合在两个人群中属于高鉴别能力的遗传标记。