SlFYFL在番茄响应干旱胁迫中的功能及其作用机制分析

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植物在生长过程中,极易受到干旱、高温、低温等非生物胁迫的影响,严重制约着植物的生长发育,造成农作物的减产,影响着农产品的品质。对于植物本身而言,在长期的进化过程中,为了适应外界不良环境的多变,植物形成了独特的应对非生物胁迫的防御机制。番茄(Solanum lycopersicum L.)是全世界栽培量最大的蔬菜之一,其栽培过程中常受到各种非生物胁迫的影响,使其生长发育受限。因此,以番茄为材料研究植物的抗逆性,不仅可揭示植物的抗逆机制,也可为培育抗逆新品种奠定一定的理论基础。MADS-Box家族转录因子在植物体内几乎所有器官以及整个植物生命周期中都起着重要作用。在番茄中,关于MADS-Box家族转录因子的功能研究主要集中在调控番茄果实成熟方向,而随着对该家族基因的研究不断深入发现,MADS-Box家族基因在番茄非生物胁迫的响应中也存在着至关重要的作用,其中一些基因同时参与了调控植物的生长发育、果实成熟及非生物胁迫响应。前期研究发现,番茄MADS-Box家族SlFYFL基因可以同时调控番茄的生长发育、果实成熟以及对非生物胁迫响应,因此,探究其功能就显得尤为重要。本研究以MADS-Box家族SlFYFL基因及其启动子为研究对象,对该基因进行生物信息学分析和启动子顺式作用元件分析;利用荧光定量PCR对该基因进行诱导因素和表达模式分析;通过遗传转化获得转基因株系并对其后代进行干旱处理,观察其在干旱胁迫下的表型并测定该基因以及对干旱胁迫响应的相关基因的表达变化和相关生理指标的变化;采用酵母单、双杂交技术对番茄c DNA文库进行筛选,寻找可能的SlFYFL上游调控基因和SlFYFL的互作蛋白,进而初步分析该基因在番茄响应干旱胁迫过程中的功能。主要研究结果如下:1.通过对野生型番茄植株施用不同的外源激素(ABA、GA、Eth等)和不同非生物胁迫(干旱、高温、低温等)处理,利用q RT-PCR分析SlFYFL基因的诱导因素和逆境表达模式,结果表明ABA、Eth和JA激素可能参与调控该基因的表达,同时受番茄的干旱、高盐等非生物胁迫的诱导表达,其中干旱胁迫的诱导表达最为显著。2.对SlFYFL的T3代超表达及敲除株系进行干旱处理,结果表明SlFYFL超表达植株相较于野生型番茄植株表现出了明显的抗旱性,相反敲除株系SlFYFL-A-24表现出对干旱胁迫的敏感性。3.对APX2、CAT1、CAT2、P5CS、PR1和GME2进行q RT-PCR分析,发现干旱处理后超表达株系中APX2和CAT1表达量较野生型显著升高,敲除株系显著降低,其他基因无显著变化,推测SlFYFL基因可能通过调控APX2和CAT1的表达来调控番茄对干旱胁迫的响应过程;对ABA相关基因SlPP2C2、SlNCED、SlAREB1、SlABI5和Eth相关基因ACO1、ACO3、ACS2、ERF1进行q RT-PCR分析,发现干旱处理后超表达株系中SlPP2C2、SlNCED、SlABI5、ACO3、ACS2、ERF1表达量较野生型均呈现出下调趋势,Sl AREB1呈现出上调趋势,因此我们推测SlFYFL可能通过参与ABA和Eth途径调节番茄的抗旱性。4.使用Plantcare对SlFYFL基因的启动子顺式作用元件进行分析,选取特异性引物扩增得到SlFYFL基因的启动子连接至p Ab Ai载体并转化Y1HGold酵母细胞进行抑制酵母生长的AbA浓度进行筛选,进而对番茄cDNA文库筛选,在文库中共筛选出12个基因,从中挑选出Solyc04g082000、Solyc07g055060、Solyc06g008970、Solyc07g007630、Solyc04g011370、Solyc03g115900、Solyc04g082010、Solyc02g063150、Solyc10g007270基因分别进行点对点互作,发现其均可与SlFYFL基因的启动子发生体外互作。其中,9个基因可能分别参与植物受到的伤害响应、干旱响应、高温响应、低温响应、盐胁迫响应和激素响应途径。因此,SlFYFL在番茄响应干旱胁迫中的表达可能受到这9个基因的调控。5.通过将SlFYFL基因的CDS序列连接至pGBKT7载体并转化Y2HGold酵母细胞进行番茄c DNA文库筛选,在文库中筛选出AGL66可能为其互作蛋白。因筛出蛋白数量过少,通过STRING网站预测得到2个可能与SlFYFL蛋白互作的相关蛋白APRR1与HB51。通过点对点验证互作发现SlFYFL可与AGL66和HB51发生体外互作,其主要分别参与调控花粉、花粉管和花发育途径,推测SlFYFL在响应干旱等逆境胁迫中不是通过形成蛋白复合体而是依赖上下游基因调控提高了番茄的抗旱性。
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