一、目的椎间盘源性腰腿痛是骨科常见的疾病。随着现代社会的发展,人们的工作及生活习惯的变化,腰腿痛的病例不断增多。传统手术治疗方法如髓核摘除术和椎体融合术虽然有效,但会发生腰椎失稳、腰椎负荷改变,加速了相邻节段的退变。近十年来,随着腰椎的动态固定及功能重建理念空前发展,以及各种动态固定装置技术在临床广泛应用,虽然取得了一定的临床疗效,但仍存在许多问题,为了解决这些问题,人们还在不断探索完善各种非融合技术。其中,腰椎人工髓核置换技术展现了良好的前景。人工髓核置换术更适合早、中期椎间盘退变性疾病,它尽量保留了椎间盘解剖结构的完整性,并减缓临近节段退变,手术创伤较小,恢复快。目前已知的人工髓核存在假体脱出等一系列弊病,临床应用并不广泛。为此,我们研制出一种新型可注射性人工髓核,它由两个部分组成,外部的髓核球囊由聚氨酯制成,内部的核心是聚合制成的硅橡胶。虽然聚氨酯和硅橡胶在医疗行业有广泛应用,但作为一种长期内植物,还需要根据植入医疗器械的生物相容性标准,通过一系列实验对人工髓核材料进行遗传毒性的研究,来评估其生物安全性。二、方法1.参照医疗器械生物学评价标准,聚氨酯、硅橡胶样品分别称量25g,剪成2~3mm颗粒,按样品质量与浸提介质比例为0.2 g/ml加入125 ml浸提介质,制取浸提溶液。选健康雄性成年SD大鼠,多氯联苯(ArOclorl254),按500 mg/kg腹腔注射,动物诱导,5日后处死,取出肝脏,在组织匀浆器上制成肝匀浆,低温高速离心,吸出上清液即为S9组分,配成S9混合液。2.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验):采用平板渗入法。分别为聚氨酯组、硅橡胶组,并设阴性对照组、溶剂对照组、阳性对照组。选用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门杆菌TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535试验菌株。将聚氨酯、硅橡胶浸提液稀释,设置4ul/皿、10ul/皿、40ul/皿、100ul/皿、200ul/皿5个剂量,采用浸提介质作为溶剂对照,阴性对照不加处理,阳性对照物如下:不加代谢活化系统(S9)时,TA97选用阿的平(500 ug/皿),TA98选用对硝基喹啉(200 ug/皿),TA100和TA102选用甲基磺酸甲酯(1ul/皿),TA1535选用叠氮钠(3ug/皿);加入S9时,TA97,TA98和TA100选用2-氨基芴(10ug/皿),TA102选用1,8-二羟基蒽醌(50 ug/皿),TA1535选用2-氨基蒽(2ug/皿)。试验菌株增菌液0.1ml、受试样品溶液0.2ml和S9混合液0.5ml(需代谢活化时),充分混匀到平板,置于37℃培养箱里孵育48h,记录每皿回复菌落数。每个受试样品检测皿加或不加S9混合液均作三个平行皿。3.染色体畸变试验:分为聚氨酯组和硅橡胶组,采用DMEM细胞培养基作为阴性对照,阳性对照在不加S9时使用丝裂霉素C(0.25ug/ml),加入S9时使用环磷酰胺(20ug/ml)。设置样品浓度组如下:高浓度组5000ug/ml,中浓度组2500ug/ml,低浓度组1250ug/ml。试验前一天,选取生长良好的CHO细胞,配成2×105个/ml细胞悬液5ml接种于培养瓶中,放CO2培养箱内培养24h。试验时吸去培养瓶中的培养液,根据分组加入高、中、低三种不同浓度的受试样品溶液或阴性、阳性对照物4.5ml,S9混合液0.5ml(不加S9混合液时用相应溶液补足),放培养箱中培养4h,吸出培养基,用Hanks液洗细胞3次,加入含10%胎牛血清的培养基5ml,放回培养箱培养24h,于收获前4h,加入秋水仙素(浓度为1μg/ml)。按常规方法消化、低渗、固定、制片和染色,观察各组细胞有丝分裂细胞数,每组选200个分散良好的中期分裂相,镜下观察记录染色体畸变数目及类型,计算染色体畸变细胞百分比。4.微核试验:分为聚氨酯组和硅橡胶组,设置生理盐水作为阴性对照,环磷酰胺(40mg/kg)作为阳性对照。1月龄昆明种小鼠32只,体重20～32g,按性别区分后随机分入各组,每组8只,雌、雄性各半。采用口腔灌胃方式,试验组注入材料浸提液(25ml/kg),阴性对照组注入生理盐水(25ml/kg),阳性对照组注入浓度为1.6mg/ml的环磷酰胺生理盐水溶液(25ml/kg)。采用30h两次给药法,两次给药间隔24h,第二次给药后6h取材。颈椎脱臼处死动物后,剥离取出一侧股骨,用1ml小牛血清将骨髓细胞冲入离心管内,混匀、离心,弃去上清液,混匀剩余细胞后取一滴置于载玻片上,推片晾干,按常规方法瑞士-姬姆萨染色。每只小鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞,记录其中微核与微核细胞数,计算微核细胞率。三、结果1.Ames试验受试样品各个剂量组中5个试验菌株在加入代谢活化系统(S9)和不加S9条件下,回变菌落数均低于阴性对照组的2倍,因此判定Ames试验结果为阴性。2.染色体畸变试验聚氨酯浓度为5.0、2.5、1.25mg/ml时,CHO细胞的有丝分裂指数分别为2.72%、2.60%、2.72%,而在相应浓度硅橡胶作用下,CHO细胞的有丝分裂指数分别为2.54%、2.74%、2.68%,与阴性对照组2.78%比较均无显著性差异(P>0.05)。除部分试验组(1.25mg/ml聚氨酯加S9、1.25mg/ml聚氨酯不加S9、1.25mg/ml硅橡胶加S9、2.5mg/ml硅橡胶不加S9)染色体畸变率为0.5%外,余各试验组染色体畸变率均为0%。所有试验组染色体畸变率与阴性对照组(加S9时为0.5%,不加S9时为0%)比较均无显著性差异(P>0.05),但与阳性对照组(加S9时为29.5%,不加S9时为26.5%)比较均显著降低(P<0.01)。3.微核试验5g/kg聚氨酯作用后,小鼠骨髓细胞的微核细胞率分别为2.38‰±1.06‰,而5g/kg硅橡胶作用后,小鼠骨髓细胞的微核细胞率为2.88‰±2.17‰,与阴性对照组(1.63±1.19‰)比较无显著性差异(P>0.05),但均显著低于阳性对照组(36.25‰±8.54‰,P<0.01)。四、结论Ames试验、染色体畸变试验、微核试验从DNA、染色体和基因三个水平的检测,均取得了阴性结果,说明聚氨酯、硅橡胶材料对生物体的遗传没有产生影响,没有遗传毒性,同时也为其进一步的临床研究提供生物学依据。