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正常生理情况下,细胞内的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平会维持在一定的范围内,并发挥其重要的生理功能。外源或病理因素会导致机体的氧化还原状态失衡,进而引起ROS的积累。ROS具有强氧化性,会对机体细胞的DNA、蛋白质(包括酶)、糖脂类等重要生物大分子进行攻击,阻碍其正常生理功能的发挥,引起细胞的氧化损伤。ROS引起的细胞损伤与人类大部分的疾病相关,如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症和肺的纤维化等。因此,进行有关抗氧化的研究对了解或诊治这些疾病具有重要的意义。 SPATA12(Spermatogenesis Associated Gene12,SPATA12)是一个精子发生相关基因。在前期的工作中,本课题组发现SPATA12在紫外诱导的DNA损伤过程中发挥作用,这提示我们其可能也参与了氧化应激损伤修复过程。基于此,本文从以下三个方面探讨了SPA TA12在抗氧化损伤中的作用。 1.细胞氧化损伤模型的建立 ROS主要包括超氧阴离子(O2-·)、羟自由基(OH·)和过氧化氢(H2O2)等,是引起细胞氧化损伤的重要因素。在本研究中,采用H2O2为氧化剂,以HeLa或MCF-7为实验材料,建立细胞氧化损伤模型。用0~70μM的H2O2处理细胞8h,通过细胞形态学、MTT分析、生化检测等方法发现,随着H2O2浓度的升高,细胞的形态逐渐改变,存活率降低,细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力降低,谷胱甘肽(GSH)的含量减少;而脂质氧化产物(MDA)的含量上升,说明H2O2对细胞造成了氧化损伤。 2.SPATA12的抗氧化损伤功能及其作用机制 基于上述细胞氧化损伤模型,采用定量PCR技术分析发现,在H2O2的作用下,SPA TA12的表达明显上调,表明SPA TA12能够响应氧化应激信号的诱导。通过双荧光素酶报告基因实验发现,转录因子AP-1参与了SPA TA12应答H2O2刺激的生理过程,其位于SPATA12启动子区域的TRE元件发挥了重要作用。而HSF1 decoyODNs实验结果表明,转录因子HSF1在SPA TA12响应细胞氧化应激中的作用不明显。 随后,通过PI染色实验的分析表明,SPATA12能够抑制H2O2诱导的细胞凋亡;通过对氧化损伤相关指标的检测发现,SPATA12能够降低细胞内MDA和ROS的含量。这些结果表明,SPATA12可能具有抵抗H2O2诱导的氧化损伤的功能。 3.抗氧化中药单体对SPA TA12表达的影响 通过MTT、定量PCR等方法,我们还检测了白藜芦醇、熊果酸、槲皮素和淫羊藿苷等四种具有抗氧化作用的中药单体对SPATA12表达的影响。结果显示,20μM浓度的白藜芦醇能够上调SPATA12 mRNA的表达,而其他中药单体不能明显提高SPATA12的表达。通过双荧光素酶报告基因实验进一步发现,转录因子AP-1的TRE元件在SPATA12应答白藜芦醇的过程中同样也发挥了重要作用。 综上,本研究证实了SPATA12能够通过转录因子AP-1来应答外源ROS的刺激;初步发现SPA TA12能够抵御H2O2所诱导的氧化损伤及细胞凋亡;发现抗氧化中药单体白藜芦醇能够激活SPATA12的表达,其可以作为SPATA12的候选激活剂。