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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是导致猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease, PCVAD)的主要致病因子,主要感染猪体免疫器官,造成淋巴组织损伤、淋巴细胞减少及组织细胞浸润等病理学特征,最终可导致严重的免疫抑制。此外,PCV2感染后极易导致猪群继发感染和混合感染,给养猪业造成严重损失。PCV2基因组全长1.7 kb,为共价闭合、环状单链DNA。迄今已报道PCV2有5个ORF编码蛋白：ORF1编码复制相关蛋白Rep,负责病毒DNA的复制；ORF2编码核衣壳蛋白Cap,与病毒粒子包装及细胞自噬有关,也是PCV2主要的免疫原性蛋白；ORF3编码蛋白能够诱导细胞凋亡;ORF4编码蛋白能够抑制细胞凋亡,调控宿主T淋巴细胞；ORF5编码蛋白能够诱导内质网应激。细胞自噬在病毒的感染、复制以及致病方面均发挥重要作用,本实验室前期工作证实PCV2感染PK-15细胞可通过AMPK/ERK/TSC2/mTOR途径诱导细胞自噬以促进自身复制,但激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的分子机制尚待进一步揭示。本研究旨在阐明：(1)PCV2感染PK-15细胞激活AMPK的分子机制；(2)PCV2感染PK-15细胞除激活AMPK/ERK/TSC2/mTOR通路以外,是否有其它的自噬通路参与；(3) PCV2Cap蛋白诱导自噬的关键区域。1.PCV2感染PK-15细胞经由CaMKKβ激活AMPK利用RNA干扰、免疫印迹、激光共聚焦及实时荧光定量PCR (q-RT-PCR)等方法对PCV2感染PK-15细胞激活AMPK的分子机制进行探究。免疫印迹结果表明,PCV2感染PK-15细胞后24 h开始显著上调钙/钙调素依赖的蛋白激酶的激酶β(CaMKKB )(1.00 vs 2.20, P< 0.05),激活其底物分子AMPK(1.00 vs 2.59,P<0.01)和钙调蛋白激酶I(CaMKI) (1.00 vs 2.37, P< 0.05); CaMKKβ抑制剂STO-609或特异性小干扰RNA (siCaMKKβ)均能显著抑制PCV2诱导的MPK和CaMKI的活化。激光共聚焦结果显示,STO-609或siCaMKKβ均能显著抑制PCV2诱导的细胞内自噬小体的形成(14.6 vs 28.5, P< 0.01; 19.2 vs 29.0, P< 0.01); q-RT-PCR及病毒滴度测定显示,抑制CaMKKp (STO-609或siCaMKKβ)均能显著降低子代PCV2 DNA拷贝数(106.02 vs 108.23; 106.91 vs 1O8.36, P<0.01)及病毒滴度(TCID50) (10-2.23 vs 10-4.56, P< 0.01; 10-285 vs 10-4.35, P< 0.01)。这些结果表明,PCV2感染PK-15细胞经由CaMKKβ激活AMPK及其下游通路诱导细胞自噬。2.PCV2感染PK-15细胞激活CaMKKβ/CaMKI/WOPIl自噬通路利用RNA干扰、免疫印迹、激光共聚焦及q-RT-PCR等技术对PCV2感染PK-15细胞是否激活CaMKK(3/CaMKI/WIPIl自噬通路进行探究。结果显示,PCV2感染后12 h便能显著上调与磷酸肌醇互作的色氨酸-天冬氨酸重复蛋白1(WIPI1)的mRNA(1.00 vs 2.60, P< 0.01)及其蛋白水平(1.00 vs 1.92,P<0.05),而特异性小干扰RNA siWIP1l或siCaMKI以及CaMKI抑制剂KN93均能显著抑制PCV2的复制及其诱导的细胞自噬。此外,siAMPK能够抑制PCV2诱导的细胞自噬,但不影响CaMKI活化和WIPI1上调。激光共聚焦结果显示,PCV2感染能够促进DsRed-WIPIl点状聚集(47.0 vs 24.5,P<0.01)及DsRed-WIPIl/EGFP-LC3共定位(16.7 vs 8.7,P<0.01),这种促进作用能被STO-609或KN93缓解。以上结果表明,PCV2感染能够激活CaMKKβ/CaMKI/WIPI 1通路诱导自噬,且不依赖于AMPK。3.PCV2感染PK-15细胞经由IP3R-Ca2+途径激活CaMKKβ利用免疫印迹、ELISA和流式细胞术等技术进一步探究PCV2感染激活CaMKKβ以及Cap蛋白诱导自噬的分子机制。基于流式细胞术和荧光共振能量转移(FRET)方法的细胞浆Ca2+检测显示,PCV2感染后36 h能显著上调胞浆游离Ca2+水平(128.7% vs 100%,P<0.01),并显著提高TN-XXL蛋白的FRET发生效率(14.1% vs 2.0%,P<0.01)。这种上调作用能被三磷酸肌醇受体(IP3R)抑制剂2-APB缓解。免疫印迹显示,2-APB能够抑制PCV2感染对CaMKKβ/AMPK和CaMKKβ/CaMKI自噬通路的激活以及PCV2复制,而PCV2感染并未激活磷酯酶C-γ (PLC-γ)ELISA显示PCV2感染未上调细胞内三磷酸肌醇(IP3)水平,说明PCV2激活IP3R不是经由PLC-IP3途径。Cap及其截短表达载体(pCap、pCap1-100aa、pNLS+Cap90-190aa及pNLS+Cap185-233aa)转染PK-15细胞均能不同程度的上调细胞浆内Ca2+水平,并诱导自噬,且与Cap蛋白的核定位信号(Cap1-41 aa, NLS)无关,Cap蛋白的aa42-185可能起主要作用。此外,Cap及其截短表达不能诱导HEK293细胞发生自噬。以上结果表明,PCV2感染PK-15细胞经由Cap蛋白通过IP3R-Ca2+途径激活CaMKKβ。综上所述,本研究进一步阐明了PCV2感染诱导PK-15细胞自噬的分子机制：(1)PCV2感染经由CaMKKβ激活AMPK及其下游通路诱导PK-15细胞自噬；(2)PCV2感染也可以激活CaMKKβ/CaMKI/WIIPI1自噬通路,且不依赖于AMPK;(3)PCV2通过Cap蛋白经由IP3R-Ca2+途径激活CaMKKβ诱导自噬。研究结果为诠释PCV2的致病机理及抗PCV2药物的研发提供了基础。