鸵鸟是世界上现存体形最大的草食性鸟类,具有很高的饲养价值。雏鸵鸟由于机体的各种器官系统尚未发育完善,抵抗力低,对机体内外环境的变化和病原的侵袭非常敏感,容易发病,从而影响其生长。消化管是营养物质消化吸收的重要场所,它的发育程度决定了动物对营养物质消化吸收的情况,动物对营养物质消化吸收的多少影响动物的生长发育。非洲鸵鸟育雏期较长,在育雏期间,生长发育缓慢,胃肠道疾病严重。为了提高非洲鸵鸟的育雏率,降低胃肠道疾病的发病率,科学家们已经对非洲鸵鸟展开了大量的研究。但是到目前为止,有关非洲雏鸵鸟消化道发育规律的研究,尚未见过报道。Ghrelin是由日本科学家Kojima等人于1999年从小鼠的胃中提纯并鉴定了的一种促生长激素分泌受体的特定的内源性配体的一种脑肠肽,由胃黏膜分泌,能影响动物的摄食、饮水、消化道的活动以及动物体内其它激素的分泌、从而影响动物的生长发育。现已证明哺乳动物Ghrelin为28个氨基酸残基的多肽,禽类的Ghrelin则由26个氨基酸残基组成的多肽。Ghrelin广泛分布于多种动物的胃、回肠、肾上腺、心房、乳房、口腔黏膜、食道、输卵管、脂肪、胆囊、淋巴细胞、肾脏、脾脏、淋巴管、心脏、肺、肌肉、心肌、卵巢、精巢、胎盘、前列腺、胰腺、甲状腺、皮肤、垂体、血管中,并且它的分布随着动物年龄的变化而变化,而到目前为止,未见非洲鸵鸟Ghrelin的研究报道。综合以上两个方面的原因,本课题利用石蜡切片HE染色技术、透射电镜(TEM)技术、组织化学技术、免疫组化技术定位表达(SABC)技术及反转录PCR(RT-PCR)技术等综合手段,从组织、细胞、亚细胞、分子等多层次对雏鸵鸟消化管的形态结构、发育特点,Ghrelin的分布发育规律进行全面、系统的研究,旨在为非洲鸵鸟胃肠道疾病的预防和治疗提供可靠的理论依据。主要研究内容和研究结果包括以下5个方面：1.非洲鸵鸟消化管的形态学特点本试验以90d健康非洲雏鸵鸟为试验动物,通过光镜和电镜样本制作,采用大体解剖、石蜡切片、PAS染色、嗜银染色及HE染色技术,研究雏鸵鸟消化管的形态学结构。结果显示：非洲鸵鸟的消化管由口咽腔、食管、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠构成。非洲鸵鸟无嗉囊,其口咽腔,腺胃、肌胃、空肠和结肠比其它禽类的发达,特别是结肠,位置占据了整个腹腔后半部的大部分；消化管的组织结构从内到外依次分为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层；食管有粗大的皱襞,肌层发达,有发达的食管腺；腺胃分有腺部和无腺部,在有腺部内,腺体由位于固有膜的单管腺和位于黏膜下层发达的复管状腺组成,其中复管状腺由大量的腺细胞、少量的内分泌细胞和黏液细胞构成；肌胃含有肌胃腺,并且黏膜肌层较明显,由内纵肌和外环肌组成；小肠绒毛较长,有分支现象,未见中央乳糜管；十二指肠的固有膜中有发达的腺体和集合淋巴小结,黏膜下层内无十二指肠腺；从十二指肠到回肠,肠绒毛的汇合及分支现象更加明显,固有膜内集合淋巴小结的数量逐渐减少,空肠的绒毛弯曲明显；具有一对发达的盲肠；结肠特别发达,有黏膜皱襞,黏膜上皮为复层柱状上皮,其间夹有杯状细胞,肠绒毛短且发达。非洲鸵鸟消化管的这些形态学特点,决定了非洲鸵鸟对粗纤维具有很强的消化吸收能力。2.雏鸵鸟消化管的发育特点本研究以1d、45d和90d健康非洲雏鸵鸟为试验动物,利用大体解剖学、组织化学和形态计量学的方法,研究雏鸵鸟消化管的发育特点。研究结果显示：鸵鸟的体重,消化管的重量和长度随日龄而增加；食管、腺胃和十二指肠的相对重量在90d达到高峰,肌胃、空肠、回肠以及所有大肠的相对重量在45d达到高峰；腺胃单管腺和复管腺的厚度、肌胃腺的高度、肌胃黏膜肌层的厚度、肠绒毛的高度和宽度,肌层的厚度与日龄呈正相关；肠绒毛的高度与隐窝深度的比值在不同肠段,其变化趋势也各有差异：在空肠,从1d-90 d比值逐步减少；而在十二指肠和回肠,从1d-45d比值逐步减少,而从45d-90 d比值逐步增加；小肠绒毛杯状细胞和隐窝杯状细胞的数量从1d-45d随日龄增加而增加,45d-90d随日龄增加而减少。绒毛杯状细胞的数量在1d,空肠最高；45d,回肠最高。隐窝杯状细胞的数量在1d和90d时,回肠最高；45d时,十二指肠最高。这些结果揭示非洲鸵鸟消化道的发育从1d-90d逐步完善；特别是1d-45d,从消化道的重量、长度、肠绒毛的特点以及肠杯状细胞的变化可以看出其发育极不完善。因此,在非洲鸵鸟的饲养管理中,应加强1d-45d的饲养管理,在这阶段应饲喂易消化且营养全面的日粮,这样有助于减少雏鸵鸟消化系统疾病。3.Ghrelin阳性细胞在雏鸵鸟胃肠道的分布及发育规律本研究以1d、45d和90d健康非洲雏鸵鸟为试验动物,利用免疫组织化学SABC技术对非洲鸵鸟消化管内Ghrelin阳性细胞(Ghrelin-ic)的分布、形态学特点以及发育变化进行了研究。结果显示：Ghrelin-ic分布于整个胃肠道；腺胃,大量的Ghrelin-ic位于黏膜下层的复管腺内,少量的阳性细胞位于黏膜层的单管腺内；肌胃,Ghrelin-ic位于黏膜层的黏膜上皮下陷的漏斗状的隐窝上皮细胞内；肠道,Ghrelin-ic数量较胃内少,分布于整个肠道的黏膜层的隐窝和肠绒毛上皮细胞之间,黏膜下层和肌层未见阳性细胞。Ghrelin-ic根据其游离面是否到达腔面可分为两类,即“开放型”细胞和“闭合型”细胞,在腺胃和肌胃,主要是“闭合型”阳性细胞,“开放型”阳性细胞较少,而在小肠和大肠,主要是“开放型”阳性细胞,“闭合型”阳性细胞较少；Ghrelin-ic分布密度总的来说,在腺胃最高,从十二指肠、空肠、回肠、肌胃、盲肠、结肠到直肠分布密度逐步降低；在腺胃,阳性细胞的数量从1-45d逐步增加,并且在45d出现一个峰值；在肌胃和小肠,阳性细胞的数量从1-90d逐步增加,并且在90d出现一个峰值；从90-334d,Ghrelin-ic的数量在胃和小肠都是逐步增加,但差异不显著。以上结果说明：Ghrelin-ic在非洲鸵鸟整个胃肠道内有分布,并且其数量随着机体的发育而变化,总的趋势是：从1-90d,随着日龄的增加而逐步增加。根据这些变化可以推论,Ghrelin对非洲鸵鸟消化管的发育起一定的作用。4.非洲鸵鸟Ghrelin基因的克隆和序列分析根据GenBank中所公布鸡(GeneBank登录号：AB075215)的Ghrelin核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,以45d非洲鸵鸟腺胃组织中总RNA为模板,采用RT-PCR法,扩增出Ghrelin成熟蛋白编码cDNA序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR鉴定及序列测定与分析。结果表明：从非洲鸵鸟腺胃中扩增出了Ghrelin基因,扩增产物为191bp；利用DNAMAN将其转化成氨基酸序列,发现非洲鸵鸟Ghrelin的成熟蛋白,由28个氨基酸残基构成；同一性分析表明,非洲鸵鸟Ghrelin基因与鸡、鸭、鹅、火鸡、鸸鹋、日本鹌鹑Ghrelin基因相应序列的同一性分别为95%、94%、84%、83%、84%、84%和82%；氨基酸同一性与鸸鹋、鸡、鸭、鹅、火鸡和鹌鹑分别为88.9%、73%、69.8%、74.6%、73%和68.3%；基因和蛋白氨基酸同一性分析结果说明Ghrelin是一组在进化上高度保守的蛋白质；利用DNAMAN对Ghrelin进行进化树分析,进一步发现非洲鸵鸟与鸸鹋的亲缘关系最近。非洲鸵鸟Ghrelin成熟蛋白cDNA的成功克隆,为进一步研究非洲鸵鸟Ghrelin全基因结构、基因表达与调控奠定了基础。5.Ghrelin基因在非洲雏鸵鸟胃肠道的表达及发育性变化根据GenBank中所公布鸡(GeneBank登录号：AB075215)的Ghrelin核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,以1d、45d和90d健康非洲雏鸵鸟胃肠道组织中的总RNA为模板,采用RT-PCR法,对Ghrelin mRNA在非洲雏鸵鸟胃肠道的表达及发育性变化进行了研究。结果表明：Ghrelin mRNA除在空肠、结肠不表达外,在腺胃、肌胃、十二指肠、回肠、盲肠和直肠均有表达；Ghrelin mRNA在胃和小肠组织中的表达随着日龄的变化而变化：1d时,只在腺胃中表达；45d时,Ghrelin mRNA在腺胃、肌胃及回肠中都有表达,而在十二指肠和空肠中没有表达；90d和334d时,Ghrelin mRNA只在空肠中没有表达,而在腺胃、肌胃、十二指肠和回肠中都有表达。以上结果说明：基因在非洲鸵鸟胃肠道有表达,并且其表达呈发育性变化,这进一步说明了Ghrelin对非洲鸵鸟消化管的发育起一定的作用。